Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Summary

Les bactériophages (phages), des virus qui infectent les bactéries, font partie intégrante du microbiome intestinal. Bien que ces habitants symbiotiques déterminent la forme physique bactérienne et la dynamique des populations, on comprend peu de choses sur leur impact sur l’homéostasie intestinale et les maladies. Ce protocole étudie des phages T4 isolés dans un modèle murin, adaptable à d’autres paires phage-bactérie.

Abstract

Les bactériophages (phages) sont des virus qui infectent les bactéries avec une spécificité au niveau de l’espèce et de la souche et sont les entités biologiques les plus abondantes dans tous les écosystèmes connus. Au sein des communautés bactériennes, telles que celles que l’on trouve dans le microbiote intestinal, les phages sont impliqués dans la régulation de la dynamique des populations de microbiote et dans l’évolution bactérienne. La recherche sur les phages a connu un regain d’intérêt au cours de la dernière décennie, en partie en raison des capacités de destruction spécifiques à l’hôte des phages lytiques, qui offrent un outil prometteur pour contrer la menace croissante des bactéries résistantes aux antimicrobiens. De plus, des études récentes démontrant que les phages adhèrent au mucus intestinal suggèrent qu’ils pourraient avoir un rôle protecteur dans la prévention de l’invasion bactérienne dans l’épithélium sous-jacent. Il est important de noter que, comme les microbiomes bactériens, les phagéomes perturbés ont été associés à une aggravation des résultats dans des maladies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin. Des études antérieures ont démontré que les phages peuvent moduler le microbiome des animaux et des humains grâce à des greffes de filtrat fécal, ce qui est bénéfique pour la santé de l’hôte. Cette récente vague de recherche s’accompagne de la nécessité d’établir et de normaliser des protocoles pour étudier les phages dans le contexte du microbiome intestinal. Ce protocole fournit un ensemble de procédures pour étudier les phages T4 isolés et leur hôte bactérien, Escherichia coli, dans le contexte du tractus gastro-intestinal murin. Les méthodes décrites ici décrivent comment partir d’un lysat de phage, l’administrer à des souris et évaluer les effets sur l’hôte bactérien et les niveaux de phages. Ce protocole peut être modifié et appliqué à d’autres paires phage-bactérie et fournit un point de départ pour étudier la dynamique hôte-phage in vivo.

Introduction

Les bactériophages, ou phages, sont des virus qui infectent et tuent les bactéries avec une spécificité au niveau de l’espèce et de la souche¹. Les phages jouent un rôle important dans les communautés bactériennes complexes telles que le microbiote intestinal, où ils ont été impliqués dans la régulation de la dynamique des populations et la conduite de la fitness bactérienne². Au cours de la dernière décennie, il y a eu un regain d’intérêt pour la recherche sur les phages en raison de l’augmentation des agents pathogènes résistants aux antimicrobiens³ et du potentiel de la phagothérapie comme stratégie de traitement alternative. Ces dernières années, les cocktails de phages lytiques ont été utilisés par voie intraveineuse avec un certain succès dans les infections septiques bactériennes graves et résistantes aux antibiotiques chez l’homme ^3,4. La phagothérapie orale a également été proposée comme alternative potentielle aux antibiotiques pour traiter les infections intestinales et l’inflammation. De plus, les phages ont été impliqués dans le succès des greffes de filtrat fécal (FFT), qui sont des préparations de microbiote fécal filtrées pour éliminer les bactéries, dans le traitement de l’infection récurrente à Clostridioides difficile (^ICDr)^5,6, des troubles inflammatoires de l’intestin (MICI)^7,8 et de l’entérocolite nécrosante chez les porcs prématurés⁹. Compte tenu de ces résultats, il est important de prendre en compte les interactions entre les phages et le microbiote intestinal, et entre les phages et l’hôte mammifère, car l’ajout de nouveaux phages dans une communauté préexistante peut avoir des effets indirects sur la communauté dans son ensemble, et pas seulement sur ses bactéries cibles ^2,10.

L’étude in vitro des interactions des phages avec leurs bactéries cibles s’est avérée utile pour comprendre les mécanismes et les impacts des interactions phages et bactéries dans l’intestin. Dans ce contexte, il a été démontré que les phages T4 spécifiques d’Escherichia coli de l’ordre des Caudovirales ont besoin de domaines de type immunoglobuline (Ig) situés dans des protéines de capside externe (Hoc) hautement antigéniques à la surface du virion pour adhérer au mucus intestinal¹¹. De plus, des tests transwell ont montré que les phages T4 sont capables d’interagir avec les cultures de cellules épithéliales et de se déplacer à travers les couches cellulaires par macropinocytose^12,13. Ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle les phages peuvent interagir avec leur hôte métazoaire, même s’ils sont incapables d’infecter les cellules eucaryotes. Ces modèles, bien qu’utiles, ne disposent pas de toute la gamme d’interactions complexes qui se produisent dans un écosystème intestinal et qui sont nécessaires à une exploration complète de l’interaction tripartite entre les phages, les bactéries et l’hôte métazoaire.

Les modèles murins sont un outil important pour étudier les phages dans des environnements complexes. Une application souhaitable de l’administration de phages est une stratégie alternative pour traiter les infections résistantes aux antimicrobiens ou les agents pathogènes associés aux maladies inflammatoires chroniques, y compris les MICI. Cependant, la littérature émergente suggère que le comportement des phages in vitro ne représente pas pleinement les fonctions in vivo. Buttimer et ^al.14 ont démontré qu’un cocktail de phages était capable d’épuiser les bactéries ciblées dans un consortium simplifié de microbiote humain in vitro, mais ne pouvait pas être répliqué in vivo chez des souris gnotobiotiques colonisées par le même consortium bactéries-phages. De plus, dans un microbiome de souris conventionnel, le phage T7 a entraîné un épuisement sélectif de ses bactéries intestinales cibles, bien qu’une récupération progressive ait été observée au fil du temps, indiquant une résistance évoluée¹⁵. D’autres études ont démontré la coexistence de phages administrés par voie orale et de leurs souches bactériennes cibles in vivo ^2,16. En effet, au-delà de la coexistence phage/bactérie, l’administration de phages a entraîné des changements généralisés dans la composition et la fonction globales de la communauté du microbiote ^2,16. Ceci est pertinent dans les contextes pathologiques, car plusieurs études ont trouvé des associations entre l’augmentation de l’abondance relative des Caudovirales et des MICI ^7,8,17 qui étaient indépendantes des changements dans l’abondance bactérienne⁷. On ne sait pas encore s’il s’agit d’un facteur ou d’une conséquence de la pathogenèse de la maladie.

L’objectif historique de l’étude des phages a été la relation entre un phage et sa bactérie cible. Cependant, il est également important de prendre en compte les interactions potentielles entre le phage et la muqueuse, l’épithélium et le système immunitaire de l’hôte métazoaire. Ces interactions jouent toutes un rôle important dans la réponse globale à l’infection intestinale par les phages. Pour le démontrer, des phages ont été étudiés sur des souris sans germes (GF) afin d’élucider leur impact sur le système immunitaire sans interférence du microbiote⁸. Dans ce système, les acides nucléiques des phages ont été détectés par des récepteurs de type Toll (TLR) situés dans les endosomes des cellules immunitaires phagocytaires (macrophages et cellules dendritiques). Cela a activé la signalisation en aval et stimulé la production d’interféron (IFN)-γ⁸ ou d’IFNs de type I¹⁸ dépendant des lymphocytes T. De plus, Fluckiger et ^al.19 ont impliqué les lymphocytes T CD8⁺ mémoires dans la reconnaissance des antigènes codés par des phages (prophages), ce qui a entraîné une réactivité croisée des lymphocytes T avec les antigènes tumoraux, ce qui a entraîné une réduction de la charge tumorale. Enfin, la production d’anticorps spécifiques aux phages a été documentée dans des études sur des souris où des phages ont été délivrés à des modèles animaux de manière continue par l’eau potable ^8,20, ou par gavage oral répété pendant plusieurs mois²⁰, démontrant la capacité des protéines des phages à promouvoir des réponses immunitaires humorales. Bien que ces modes d’inoculation des phages permettent un amorçage optimal et continu du système immunitaire, ils peuvent ne pas représenter les interactions naturelles entre les phages et l’environnement intestinal, ni la cinétique de la phagothérapie appliquée par voie orale. Jusqu’à présent, un nombre limité d’études ont examiné les interactions d’un phage avec une seule espèce bactérienne dans des modèles murins monocolonisés²¹. Cependant, les souris monocolonisées se sont avérées essentielles pour déchiffrer les effets spécifiques des microbes des espèces individuelles sur le tractus gastro-intestinal (GI) et le développement immunitaire 22,23,24, et elles peuvent encore s’avérer utiles pour comprendre les interactions tripartites entre les phages, leurs bactéries cibles et l’hôte métazoaire.

Il est passionnant de constater qu’il reste encore beaucoup à apprendre sur les interactions entre les phages intestinaux et les bactéries commensales intestinales, ainsi que sur les interactions qui se produisent entre l’hôte métazoaire et les phages qui y résident. Ce protocole fournit un ensemble de procédures pour étudier le phage T4 isolé et son homologue bactérien, E. coli (K-12, BW25113), à l’aide d’un modèle murin gnotobiotique. Ces procédures standardisées fournissent également une base pour optimiser d’autres dyades phage/bactérie en adaptant les paramètres de croissance aux paires d’intérêt. Les méthodes décrites ici décrivent : (1) la préparation de lysats de phages et de véhicules T4 pour le gavage oral de souris ; (2) Administration orale de phage T4 à des souris gnotobiotiques monocolonisées par E. coli ; (3) Surveillance des niveaux de phages T4 dans les excréments et les tissus de souris au fil du temps.

Pour les résultats représentatifs présentés ici, des lysats de phages T4 purifiés ont été propagés à partir de stocks de banques de phages maintenus par le laboratoire Rohwer. La méthode Phage-on-Tap pour la propagation du phage T4 a été adaptée²⁵, comme indiqué dans ce protocole. La méthode permet d’obtenir des stocks de phages à titre élevé et à faible teneur en endotoxines en trois jours. En utilisant cette approche, 10 mL de ≥ 10¹⁰ unités formant des plaques (UFP)/mL de phage T4 avec < 0,5 unité d’endotoxine (UE)/mL ont été collectés régulièrement. Les teneurs en endotoxines recommandées pour l’administration orale ou intraveineuse chez la souris sont respectivement de ≤ 20 UE/ml et ≤ de 5 UE/kg/h (ou 0,1 UE administrée en 1 heure pour une souris de 20 g), ce qui en fait une méthode appropriée de préparation de phages pour l’inoculation in vivo . Tous les stocks de phages ont été stockés à 4 °C dans un tampon de magnésium salin (SM) (recette fournie à l’étape 1.1.5.1). E. coli a été cultivé dans des milieux LB. Pour diverses paires phage-bactérie, divers milieux de culture et conditions de croissance peuvent être adaptés à partir de ce protocole. Les phages peuvent également provenir de l’environnement, comme les eaux usées, l’eau de mer, le sol et le contenu intestinal, et peuvent être isolés et purifiés selon Sambrook et Russell²⁶ avant la préparation en utilisant les conditions de croissance et de propagation appropriées pour chaque paire phage-hôte d’intérêt²⁵. Les phages peuvent également être obtenus auprès de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) ou de banques de phages.

Protocol

Toutes les expériences ont été menées conformément aux lignes directrices établies par les protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et le Comité de biosécurité de l’Université de la Colombie-Britannique (A23-0113, B19-0038). Les souris ont été hébergées à l’Université de la Colombie-Britannique dans des conditions exemptes d’agents pathogènes au Center for Disease Modelling. Les souris C57BL/6 ont été élevées dans l’installation dans un isolateur à film flexible stérile, fourni avec un régime stérile pour souris, de l’eau, de la litière et du matériel de nidification. Les souris ont été maintenues sur un cycle jour/nuit de 12 heures. Les souris expérimentales, mâles et femelles, ont été appariées selon l’âge dans chaque expérience, allant de 6 à 12 semaines et pesant de 15 à 30 g pour toutes les expériences.

1. Préparation de lysats de phages et de véhicules pour gavage oral chez la souris

1. Purification des phages et génération de stock
   REMARQUE : Dans cette étude, les phages T4 sont cultivés et titrés en plaquant sur une pelouse de bactéries en utilisant la méthode de la gélose unique, décrite ci-dessous. La méthode de la double gélose a été décrite précédemment^25,27et peut également être utilisé avec une efficacité similaire. La méthode de la gélose à couche unique a été choisie pour ce protocole car elle offre une meilleure visibilité de la plaque²⁸.
   1. Cultiver E. coli dans 5 mL de milieu stérile LB dans des tubes de culture stériles en polystyrène ou en verre (avec bouchons). Incuber les tubes à 37 °C en agitant à 200 tr/min pendant la nuit, jusqu’à ce que la phase stationnaire soit atteinte.
   2. Préparez la gélose molle dans un flacon en verre en autocavant LB avec 0,5 % de gélose et en refroidissant à 50 °C ou moins (tout en restant liquide) avant la supplémentation. Préparez suffisamment de gélose molle pour 15 ml par assiette.
   3. Compléter la gélose molle avec du MgSO₄ et du CaCl₂ jusqu’à une concentration finale de 1 mM pour chacune. Ajouter 100 μL de culture d’E. coli pendant la nuit pour chaque 3 mL de gélose molle. Remuez doucement à l’aide d’une barre d’agitation magnétique pour homogénéiser les suppléments et la culture dans la gélose molle.
      REMARQUE : L’uniformité du volume et de la densité d’E. coli qui est ajouté à la préparation de gélose molle est essentielle (décrite dans la section des résultats représentatifs).
   4. Ajouter 15 mL de gélose molle + E. coli par boîte de Pétri (15 cm de diamètre) à l’aide d’une pipette sérologique. Laissez les assiettes prendre à température ambiante pour une utilisation le jour même.
      REMARQUE : Les assiettes prendront environ 20 minutes avec les couvercles ouverts. La gélose restera molle mais ne se déplacera pas lorsque les plaques sont inversées.
   5. Préparez 8 à 10 dilutions en série du phage T4 source dans des facteurs de 10 en diluant dans un tampon SM. Placer 5 μL de chaque dilution sur des plaques. Laisser sécher, retourner et incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit.
      1. Pour préparer un tampon de phage salin de magnésium (SM), dans 1 L de H₂O désionisé, dissoudre 100 mM de NaCl, 8 mM de MgSO₄·7H₂O et 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4). Autoclave et conserve à température ambiante.
         REMARQUE : Le lendemain, E. coli devrait avoir poussé dans une pelouse tout au long de la gélose LB molle. Des plaques, ou zones de croissance dégagées visibles dans la pelouse d’E. coli , apparaîtront là où les hôtes infectés ont tué les E . coli par les phages. Chaque plaque représente une unité de formation de plaque (pfu).
   6. Prélevez une seule plaque de la plaque de gélose souple en poussant une pointe de pipette stérile au centre de la plaque, créant un bouchon de gélose à l’extrémité de la pointe. Remettre le bouchon de la plaque en suspension dans 1 mL de tampon SM dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL. Agiter le tube à vitesse maximale pendant 1 min pour mélanger.
   7. Centrifuger le tube à 4000 x g pendant 5 min à température ambiante pour éliminer les débris du lysat. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation.
   8. Pour propager le phage isolé, répétez les étapes 1.1.1 à 1.1.3. Ajouter 100 μL du phage isolé à une aliquote de 15 mL de gélose molle contenant E. coli dans un tube conique. Retournez le tube trois fois pour mélanger et versez la gélose dans une boîte de Pétri.
   9. Laisser sécher les assiettes avant de les retourner et de les incuber toute la nuit à 37 °C. Préparez une plaque de contrôle de pelouse sans phage pour confirmer la viabilité d’E. coli .
      REMARQUE : Après une nuit d’incubation, la plaque témoin doit avoir une pelouse d’E. coli tandis que la plaque contenant des phages doit être complètement lysée.
   10. Pour extraire le phage de la plaque, ajouter 5 mL de tampon SM à la surface de la plaque débarrassée des phages et agiter à 70 tr/min sur une bascule pendant 15 min à température ambiante.
   11. Recueillir le tampon de la plaque dans un tube à centrifuger conique de 50 mL et centrifuger à 4000 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les débris de la plaque de gélose.
   12. Prélever le lysat stock de phages T4 dans un nouveau tube et le conserver à 4 °C jusqu’au titrage et à la propagation.
       REMARQUE : Les phages T4 sont stables pendant plus de 10 ans²⁵ ; cependant, la stabilité dépendra du type de phage et des conditions d’entreposage. Le titre de phage varie également avec le temps de stockage. Les phages sont sensibles au gel. Par conséquent, la cryoconservation est recommandée dans l’azote liquide et en évitant les cycles de gel-dégel car cela peut endommager les phages, réduisant ainsi le titre^{de phage 25}.
   13. Titrer le lysat de stock de phages T4 pour déterminer la concentration en pfu/mL, comme décrit précédemment 25,29,30. Un stock de phages T4 à titre élevé contiendra 10^{à 8} UFP/ml ou plus.
2. Préparation de lysats de phages expérimentaux
   1. Culture E . coli dans 5 mL de milieu LB dans des tubes de culture stériles en polystyrène ou en verre (avec bouchons). Incuber les tubes pendant la nuit à 37 °C en agitant à 200 tr/min, jusqu’à ce que la phase stationnaire soit atteinte.
   2. Sous-culture : culture d’E. coli pendant la nuit 1:50 dans un milieu de 100 mL LB dans une fiole conique en verre. Incuber à 37 °C en agitant à 200 tr/min jusqu’à ce que les bactéries aient atteint la phase exponentielle précoce à moyenne (environ 1,5 h).
      REMARQUE : Une courbe de croissance initiale peut être effectuée pour déterminer la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) à laquelle la culture bactérienne est en phase exponentielle. La culture dans un tube conique en verre est suggérée, car des preuves récentes ont montré que les phages sont capables d’adhérer à des plastiques tels que le polypropylène³¹.
   3. Ajouter 100 μL du stock de phages T4 à titre élevé de l’étape 1.1 dans la sous-culture d’E. coli et incuber à 37 °C en agitant pendant 3 h, ou jusqu’à ce que le nouveau lysat ne soit plus trouble. Prélever le lysat de phage T4 dans des tubes coniques de 50 mL et passer directement aux étapes de nettoyage ou, si nécessaire, conserver à 4 °C jusqu’au lendemain.
      REMARQUE : Une plus grande taille de burst de phage (indiquant un nombre moyen plus élevé de virions libérés par cycle de réplication) nécessite une période d’incubation plus longue pour la sous-culture bactérienne à l’étape 1.2.2. Cela permet d’augmenter la densité bactérienne avant de se doper des stocks de phages.
   4. Centrifuger les lysats à 4000 x g pendant 20 min à température ambiante pour granuler les bactéries et les débris cellulaires restants. Stériliser le surnageant obtenu à l’aide d’un filtre en nylon de 0,22 μm et transférer le filtrat dans de nouveaux tubes à centrifuger coniques de 50 mL.
   5. Ajoutez 0,1 volume de chloroforme à chaque volume de lysat de phage T4 filtré pour tuer les bactéries restantes et empêcher la croissance bactérienne. Agiter brièvement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min.
      REMARQUE : Les phages enveloppés de lipides sont sensibles au chloroforme, ce qui peut réduire le titre^{de 25} des phages. Ignorez cette étape si nécessaire.
      ATTENTION : Le chloroforme est un solvant organique toxique qui est dangereux lorsqu’il est inhalé, ingéré ou absorbé par la peau. Utilisez une hotte et un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous travaillez avec du chloroforme. Utilisez des pipettes sérologiques en verre plutôt qu’en polystyrène lorsque vous travaillez avec du chloroforme, car il n’est pas compatible avec la plupart des plastiques. Le chloroforme peut être placé dans des tubes à centrifuger coniques en polypropylène pour les étapes 1.2.5 à 1.2.6, mais ne doit pas être stocké à long terme dans des tubes en plastique.
   6. Centrifuger le lysat à 4000 x g pendant 5 min à température ambiante pour séparer le chloroforme du lysat. À l’aide d’une pipette sérologique, transférez soigneusement la couche supérieure de lysat dans un nouveau tube conique de 50 mL sans perturber la couche de chloroforme sous-jacente. Jeter les déchets de chloroforme dans le contenant approprié pour les déchets liquides dangereux. Conserver les lysats à 4 °C jusqu’à concentration et échange de tampon le lendemain.
   7. Concentrer les lysats de phages dans un dispositif de filtration centrifuge de 100 kDa (voir le tableau des matériaux) en ajoutant 13 mL de lysat de phages dans le réservoir supérieur de l’appareil et en centrifugeant à 4000 x g pendant 5 minutes, ou jusqu’à ce que la majeure partie du lysat ait traversé le filtre dans le réservoir inférieur.
      REMARQUE : Essayez d’avoir environ 2 ml de lysat à la fin du temps d’essorage. À mesure que la concentration de phages augmente dans le filtre avec l’ajout de lysat, les temps d’essorage augmenteront probablement. Les dispositifs de filtration centrifuge ont une butée physique pour les empêcher de tourner à sec³². Ne laissez pas la membrane filtrante sécher si une utilisation continue est prévue (c’est-à-dire en retirant tout le liquide du réservoir supérieur). Les temps d’essorage peuvent varier en fonction du type de phage et du titre.
   8. À l’aide d’une pipette P200 ou P1000, pipeter doucement les ~2 mL de lysat restants de haut en bas dans le réservoir supérieur pour déboucher la membrane filtrante après chaque essorage. Jeter le filtrat du réservoir inférieur dans un récipient à déchets, en laissant le phage concentré dans le réservoir supérieur.
   9. Répéter les étapes 1.2.7 à 1.2.8 jusqu’à ce que tout le volume de lysat de phage ait été passé à travers le dispositif de filtration, avec ~2 mL de phage concentré retenu dans le réservoir supérieur après chaque essorage.
   10. Déboucher la membrane filtrante après le dernier essorage en pipetant le lysat restant (~2 mL) dans le réservoir supérieur de haut en bas. Laver le phage (échange de tampon) en ajoutant 12 mL de tampon SM dans le réservoir supérieur et centrifuger à 4000 x g pendant 10 min, ou jusqu’à ce que la majeure partie du tampon soit passée à travers le filtre.
   11. Jetez le filtrat et répétez l’étape de lavage (étape 1.2.10). Remettre en suspension les 2 mL restants de lysat dans le tampon SM jusqu’à un volume final de 10 mL (ou moins), pour un stockage à long terme. Transférez le lysat dans un tube à centrifuger conique de 50 mL et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce que les endotoxines soient éliminées.
       REMARQUE : Il est facultatif de titrer le phage à ce stade pour s’assurer que le lysat de phage a été concentré (> 10⁸ pfu/mL) et pour déterminer la perte de phage pendant le processus d’élimination des endotoxines.
   12. Éliminer les endotoxines contaminantes du lysat de phage T4 en ajoutant 0,4 volume de 1-octanol (voir le tableau des matériaux) au volume total de lysat.
       REMARQUE : Les endotoxines sont éliminées car elles sont hautement immunostimulantes, et leur présence peut donc conduire à l’induction d’une réponse immunitaire innée indépendante des phages²⁵.
       ATTENTION : Le 1-octanol est un composé aromatique, organique et inflammable avec une forte odeur et est un irritant pour les yeux. Portez l’EPI approprié lorsque vous travaillez avec du 1-octanol. Effectuez tous les travaux dans une hotte pour éviter l’inhalation de vapeur. Utilisez un film d’étanchéité pour éviter les fuites de tubes lorsque vous travaillez à l’extérieur de la hotte.
   13. Scellez le couvercle du tube à centrifuger conique avec un film d’étanchéité pour éviter les fuites. Agiter à 120 tr/min sur une plate-forme ou un agitateur à bascule à température ambiante pendant 1 h, suivi d’une incubation à 4 °C pendant 1,5 h, sans agiter.
   14. Centrifuger à 4000 x g pendant 10 min pour séparer le lysat éliminé des endotoxines du 1-octanol. La couche de 1-octanol flottera au-dessus du lysat. Utilisez une pipette P1000 pour prélever soigneusement la plus grande quantité possible de 1-octanol et jetez-la dans le récipient approprié pour les déchets liquides dangereux/inflammables.
   15. À l’aide d’une aiguille de 18 g et d’une seringue de 10 ml, recueillir le lysat de phage sous la couche de 1-octanol restante, en prenant soin de ne pas prélever la couche de 1-octanol. Conserver le lysat à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit sous vide rapide.
   16. Transférer 1 mL d’aliquotes de lysat de phage T4 dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL. Accélérer le vide avec les couvercles ouverts à 4000 x g à température ambiante pour évaporer le 1-octanol résiduel du lysat. Vide rapide pendant 3 h ou jusqu’à ce que le volume du lysat de phage ait été réduit de 30 %²⁵. Conserver à 4 °C jusqu’au titrage.
   17. Titrer le lysat de phage pour déterminer la concentration en pfu/mL. Diluez le lysat de phage T4 résultant dans un tampon SM à la concentration souhaitée et ré-titer pour confirmer.
   18. Quantifier les endotoxines présentes dans le lysat de phage T4 à l’aide d’une trousse de quantification des endotoxines chromogènes selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matières). Comparez les niveaux d’endotoxines dans le lysat de phage final avec un échantillon de pré-élimination des endotoxines, des témoins de véhicules, un tampon et de l’eau potable de souris.
       REMARQUE : Le kit de quantification des endotoxines chromogènes est inactivé par le 1-octanol²⁵. Effectuer des étapes de vide rapide pour éliminer le 1-octanol (étape 1.2.16) avant de quantifier les endotoxines. La teneur en endotoxines de l’eau distillée est estimée à 20 UE/ml²⁵ ; cependant, la teneur en endotoxines de l’eau potable des souris peut varier d’une installation à l’autre. Si les concentrations d’endotoxines dans le lysat de phage dépassent la quantité présente dans l’eau potable, envisager de répéter les étapes d’élimination des endotoxines (1.2.12-1.2.16).
   19. Conserver les lysats de phages T4 concentrés et exempts d’endotoxines dans un tampon SM à 4 °C.
3. Préparation d’un lysat bactérien sans phages pour la commande de véhicules
   REMARQUE : Un lysat bactérien sans phage peut être préparé pour contrôler tout effet dû aux contaminants bactériens (p. ex., endotoxine) générés lors de la production de lysat de phage à l’étape 1.2, qui pourraient avoir une incidence sur les résultats expérimentaux lorsqu’il est inoculé à la souris.
   1. À partir d’une culture nocturne d’E. coli, sous-culture de E . coli 1:50 dans 100 mL de milieu LB. Sans ajouter de phage, continuer à cultiver la bactérie en agitant à 37 °C pendant 3 h, ou en respectant le temps d’incubation du lysat de phage produit à l’étape 1.2.
   2. Transférer la culture d’E. coli dans des tubes coniques de 50 mL et lyser les cellules à l’aide d’une sonde sonicatrice (voir le tableau des matériaux) sur de la glace à 30 kHz pendant des impulsions de 30 s (3x) pour lyser manuellement les cellules bactériennes.
   3. Suivez le reste du protocole selon l’étape 1.2, en commençant par l’étape 1.2.4, y compris toutes les étapes de nettoyage, de lavage et d’élimination des endotoxines.
      REMARQUE : Lors de la concentration à l’aide du dispositif de filtration centrifuge, le lysat du véhicule s’écoulera à travers le filtre plus rapidement que le lysat de phage, en raison de l’absence de phage. Par conséquent, raccourcissez les temps de centrifugation de 5 minutes à 2-5 minutes pour vous assurer que la membrane ultrafiltrante ne se dessèche pas lors d’une centrifugation prolongée.
   4. Titrez le lysat du véhicule pour confirmer qu’il ne contient pas de phage.
   5. Utilisez une trousse de quantification des endotoxines chromogènes selon les instructions du fabricant pour mesurer les niveaux d’endotoxines dans le lysat du véhicule. Diluer le lysat de véhicule dans un tampon SM pour correspondre aux niveaux d’endotoxines dans le lysat de phage.
4. Contrôles expérimentaux alternatifs : préparation de lysat de phages inactivé par la chaleur
   REMARQUE : Une alternative au lysat bactérien sans phage est un lysat de phage inactivé par la chaleur. L’inactivation thermique dissocie les virions des phages, tandis que les endotoxines résiduelles telles que les lipopolysaccharides (LPS) sont thermostables ^8,33. Cette méthode a été utilisée par Gogokhia et ^al.8 pour déterminer si des virions de phages intacts et viables étaient nécessaires pour l’activation immunitaire. Les chercheurs sont encouragés à tester les deux méthodes (sans phages ou inactivées par la chaleur) et à déterminer quel contrôle est le plus approprié pour leurs besoins expérimentaux. Quel que soit le choix choisi, il est important de reconnaître qu’un contrôle tampon est peu susceptible d’être approprié en raison de la manipulation importante nécessaire pour concentrer et nettoyer un stock de phages.
   1. Transférez le volume requis de lysat de phages T4 nettoyé, purifié et dilué de l’étape 1.2 (100 μL par souris) dans des tubes de microcentrifugation stériles munis de verrous de couvercle.
   2. Chauffer les lysats sur un bloc chauffant à 95 °C pendant 15 min¹⁶.
   3. FACULTATIF : Si l’élimination des acides nucléiques phage/bactériens est nécessaire, effectuer un traitement à la DNase I et à la RNase A conformément à Jakočiūnė et Moodley³⁴. Brièvement:
      1. Ajouter 50 μL de tampon DNase I 10x, 1 μL de DNase I (1 U/μL) et 1 μL de RNase A (10 mg/mL) (voir le tableau des matières) à 450 μL de lysat de phage inactivé par la chaleur.
      2. Incuber les lysats à 37 °C pendant 1,5 h dans un bloc thermique, sans agiter.
      3. Inactiver la DNase I et la RNase A en ajoutant 20 μL 0,5 M d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)³⁴.
   4. Maintenir les lysats à température ambiante pendant 10 minutes pour refroidir et combiner les lysats si plusieurs tubes sont utilisés. Conserver à 4 °C jusqu’au titrage.
   5. Effectuez un titre de phage pour confirmer qu’aucun phage T4 viable n’est présent dans le lysat. Conserver les lysats inactivés par la chaleur à 4 °C.
   6. Utilisez une trousse de quantification des endotoxines chromogènes selon les instructions du fabricant pour mesurer les niveaux d’endotoxines dans le lysat inactivé par la chaleur. Diluer le lysat inactivé par la chaleur dans un tampon SM en fonction des niveaux d’endotoxines présents dans le lysat de phage apparié.

2. Administration et surveillance du phage T4 chez les souris monocolonisées par E. coli

1. Monocolonisation de souris par E. coli
   1. Préparez E. coli pour l’administration à des souris GF⁸ en cultivant E . coli prélevé sur une seule colonie dans un milieu LB pendant la nuit.
   2. Dans des conditions strictes et stériles³⁵, administrer 200 μL de culture d’E. coli à des souris GF logées dans des isolateurs vinyliques stériles ou des cages hermétiques de bioexclusion par gavage oral. Si vous utilisez des bactéries aérotolérantes, les souris peuvent également être colonisées par l’application de 200 μL de culture bactérienne sur le dos de chaque souris.
      REMARQUE : La dose d’inoculation dépendra de la souche, car différentes bactéries présentent une capacité de survie au pH différent^36,37. Zucoloto et ^al.35 recommandent l’inoculation avec 1 x 10⁸ ufc par animal. Les résultats représentatifs présentés ici ont été générés à partir de souris inoculées avec une culture de nuit (ufc n’a pas été déterminé). Des expériences pilotes peuvent être réalisées pour déterminer une dose qui entraîne une colonisation fiable de la souche de souris d’intérêt. Le volume de bactéries à administrer par gavage oral peut être affecté par l’âge et le poids des souris. Consultez le protocole d’éthique animale de laboratoire ou d’établissement pour connaître les doses maximales autorisées. Le volume suggéré ici est basé sur une tolérance de gavage de 10 % du poids corporel de la souris (par exemple, 200 μL maximum pour une souris de 20 g). Certaines espèces bactériennes ne tolèrent pas l’acidité de l’estomac et ne parviennent pas à coloniser l’intestin. Envisager d’abord un gavage avec 100 μL de 1 M de NaHCO₃ pour neutraliser les acides gastriques². Si vous utilisez un anaérobie strict pour coloniser, le microbe devra être cultivé dans des conditions anaérobies et transféré à l’animalerie gnotobiotique dans des récipients hermétiques préparés individuellement (1 pour chaque souris). Effectuez chaque gavage rapidement une fois le récipient ouvert pour limiter la perte de viabilité microbienne due à l’exposition à l’oxygène.
   3. Surveiller les souris pour détecter les effets néfastes sur la santé.
      REMARQUE : En cas d’effets néfastes sur la santé, se référer aux normes établies par l’établissement de soins aux animaux concerné. Les effets indésirables possibles sur la santé comprennent, sans s’y limiter : (1) Aspiration de liquide de gavage : les symptômes comprennent l’expulsion de bulles par le nez, la respiration « bouche ouverte » / halètement. (2) Perforation de l’œsophage : les symptômes comprennent une santé rapidement malade, une courbure, une léthargie, entraînant la mort de l’animal dans les 24 heures. (3) Inflammation de l’œsophage due à des gavages répétés : les symptômes incluent une difficulté à insérer l’aiguille du gavage. (4) Diarrhée due à des altérations du microbiome.
   4. Confirmer la colonisation bactérienne dans les boulettes fécales par culture au moins une fois par semaine et/ou par séquençage de l’ARNr 16S³⁵.
      REMARQUE : Si vous colonisez des reproducteurs dans un isolateur gnotobiotique pour la production de souris expérimentales, planifiez au moins 9 semaines à l’avance la génération de souris expérimentales de première génération de progéniture (F1) âgées de 6 semaines. Alternativement, les souris adultes GF peuvent être monocolonisées. Dans cette approche, il est recommandé d’attendre 7 semaines après la colonisation avant l’inoculation des phages, car c’est le temps nécessaire à la muqueuse intestinale pour se stabiliser après l’introduction d’un microbiote complexe chez les souris GF³⁸.
2. Inoculation orale du phage T4 chez des souris monocolonisées par E. coli
   1. Diluer les lysats de phages T4 et les témoins de véhicules à une concentration prédéterminée dans le tampon MS. Selon Hsu et ^al.2, diluer les lysats de phages pour permettre l’administration de 2 x 10⁶ pfu par souris².
      REMARQUE : Une concentration plus ou moins élevée de phage peut être utilisée en fonction de la stabilité du phage in vivo. Des doses de 2 x 10², 2 x 10⁴ et 2 x 10⁶ pfu de phage T4 par souris ont entraîné une colonisation stable et à long terme dans l’intestin qui ne semblait pas dépendre de la dose (voir la section des résultats représentatifs). La cinétique des phages-bactéries doit donc être testée in vivo avant les expériences à grande échelle.
   2. Dans des conditions stériles et gnotobiotiques, gaver chaque souris avec 100 μL de NaHCO₃ 1 M autoclavé pour neutraliser les acides gastriques. Attendre 10 min, puis gavage avec 100 μL de lysat de phage T4 ou contrôle du véhicule.
   3. Surveiller les souris pour détecter les effets néfastes sur la santé.

3. Surveillance des niveaux de phages T4 in vivo

REMARQUE : Une fois que les souris ont été inoculées avec des phages, la concentration des phages et des bactéries cibles peut être mesurée dans des échantillons de matières fécales ou de tissus. Cela fournit des informations sur la cinétique de l’infection par les phages et la dynamique de colonisation des deux organismes.

1. Placage ponctuel du phage T4 pour déterminer la concentration dans les boulettes fécales
   1. Prélevez les boulettes fécales de chaque souris dans des tubes à microcentrifuger stériles et pré-pesés pour mesurer les niveaux de phages T4 et d’E. coli . Conserver les tubes sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient placés.
      REMARQUE : Placez les échantillons sur de la glace entre le prélèvement et le placage pour ralentir la croissance des bactéries aérotolérantes. Pendant plusieurs heures, il peut encore y avoir une croissance de bactéries aérobies, ou une mort de bactéries anaérobies due à l’exposition à l’oxygène, ce qui pourrait entraîner un nombre asymétrique de bactéries. Par conséquent, le placage bactérien et phagique doit être effectué dès que possible après le prélèvement de l’échantillon. Les bactéries anaérobies obligatoires ne tolèrent pas l’exposition à l’oxygène. Pour préserver l’échantillon, prélevez les échantillons dans des tubes scellés et transférez les tubes dans une chambre anaérobie dès que possible après le prélèvement. Si aucune croissance n’est détectée dans les échantillons fécaux, envisagez des alternatives telles que la qPCR de l’ARNr 16S pour la quantification bactérienne.
   2. Enregistrer le poids final de chaque tube et calculer le poids de l’échantillon en soustrayant le poids initial du tube. Cela sera utilisé pour normaliser la concentration de phages T4 et d’E. coli au poids de l’échantillon (pfu/g ou ufc/g, respectivement).
   3. Ajouter 1 mL de tampon SM stérile dans chaque tube et agiter complètement à vitesse maximale (>1 min) pour homogénéiser les granules fécales. Si l’échantillon est inférieur à 15 mg, un plus petit volume de tampon SM peut être ajouté. Enregistrer le volume de tampon MS ajouté à chaque échantillon pour calculer l’ufc/g ou l’ufp/g de l’échantillon.
   4. Préparer une série de 8 dilutions en série (ou plus selon la concentration attendue dans le lysage) de 20 μL de chaque échantillon dans 180 μL de tampon SM, par facteur de 10. Vortex chaque échantillon homogénéisé brièvement pour mélanger avant de l’ajouter au premier tube/puits. Pipeter pour mélanger entre chaque ajout et changer les pointes entre chaque dilution pour éviter de gonfler le nombre de phages ou de bactéries via le transfert d’échantillon.
      REMARQUE : Si les fibres et les débris présents dans l’échantillon entravent le pipetage, ajoutez un tampon supplémentaire à la boue fécale pour diluer davantage l’échantillon de base.
   5. Placer 5 μL de chaque dilution sur des plaques de gélose molle LB contenant E. coli (pour les tests sur plaques de phages) ou des plaques de gélose LB (gélose à 1,5 %, pour les tests de colonies bactériennes) pour déterminer la concentration de phages T4 et d’E . coli dans chaque échantillon. Pour plus de précision, repérez chaque échantillon en trois exemplaires.
      NOTA : Si vous préparez des dilutions en série dans une plaque à 96 puits, une pipette multicanaux P20 à 8 canaux peut être utilisée pour pipeter chaque colonne d’échantillon dilué en série sur des plaques. Changez les pointes entre chaque dilution, même si vous passez de la plus diluée à la plus concentrée, car le phage peut adhérer aux parois de la pointe de la pipette et modifier la quantité de phage ajoutée à chaque nouveau puits³¹.
   6. Laissez sécher chaque endroit avant de retourner la plaque et de la placer dans l’incubateur. Incuber toute la nuit à 37 °C.
   7. Pour chaque échantillon, sélectionnez la dilution à laquelle il y a 3 à 30 plaques dénombrables par endroit. Comptez et notez le nombre de plaques à l’endroit et la dilution utilisée.
   8. Calculer le pfu/g de l’échantillon en divisant le nombre de plaques par le volume plaqué à chaque endroit pour obtenir le pfu/μL. Multiplier ce chiffre par le facteur de dilution et par le volume de tampon MS ajouté à chaque échantillon pour obtenir le pfu/échantillon. Enfin, divisez par le poids de l’échantillon pour obtenir³⁰ pfu/g.
      
      
2. Échantillonnage de tissus aux paramètres expérimentaux
   1. À chaque moment choisi, euthanasier les souris conformément au protocole d’éthique animale approuvé par l’établissement et recueillir le contenu cæcal, le contenu de l’intestin grêle et du gros intestin et tout tissu d’intérêt dans des tubes à microcentrifuger stériles et prépesés de 2 mL à fond rond.
   2. Enregistrer les poids finaux de chaque tube pour calculer le poids de l’échantillon. Conservez les mouchoirs et le contenu cæcal sur de la glace jusqu’au jour même du placage.
   3. Ajouter un tampon SM stérile dans chaque tube et noter les volumes ajoutés.
   4. Pour le contenu cæcal et intestinal, échantillonner soigneusement les vortex (>1 min) conformément à l’étape 3.1.3.
   5. Pour les échantillons de tissus, ajoutez une bille métallique stérile dans chaque tube. Homogénéiser les tissus à l’aide d’un lyseur tissulaire (voir tableau des matériaux) à 20 Hz pendant 5 min ou jusqu’à ce que les tissus soient dissociés et que la suspension soit homogène.
      REMARQUE : Si les échantillons ne s’homogénéisent pas bien, envisagez d’augmenter le volume de tampon SM ajouté, d’augmenter le temps d’homogénéisation ou d’augmenter la fréquence d’homogénéisation à 30 Hz. Un homogénéisateur de tissus peut également être utilisé pour dissocier les tissus tout en permettant la récupération des bactéries et des phages^39,40. Les homogénéisateurs fonctionnent à des fréquences plus élevées que les lyseurs tissulaires tout en préservant l’intégrité des bactéries.
   6. Préparer des dilutions en série de chaque échantillon par facteur de 10 et effectuer un placage ponctuel pour déterminer les concentrations de phages E. coli et T4 dans chaque échantillon, comme décrit à l’étape 3.1.4-3.1.8⁴¹.

Representative Results

Pour étudier les interactions entre la dyade phage/E. coli T4 dans l’intestin murin, le phage T4 et les lysats de véhicule ont été préparés, nettoyés et purifiés (Figure 1A). Les lysats de phages T4 ont été titrés par test sur plaque et dilués à 2 x 10⁷ pfu/mL (2 x 10⁶ pfu/souris) dans un tampon SM. Les lysats de véhicule ont également été titrés pour confirmer l’absence de présence de phages viables et dilués dans le même volume de tampon SM que le lysat de phage T4. Les niveaux d’endotoxines ont été quantifiés dans des lysats dilués à l’aide d’un kit de quantification d’endotoxines chromogènes. Les lysats de phage T4, de phage inactivé par la chaleur et de véhicule présentaient des niveaux d’endotoxines inférieurs aux niveaux acceptables pour l’eau potable (<20 UE/mL)²⁵ (figure 1B). Comme le lysat du véhicule contenait une quantité d’endotoxine similaire à celle du lysat de phage T4, il a été jugé comme un témoin approprié. Le lysat de phage inactivé par la chaleur (2 x 10⁷ UFP/mL avant traitement thermique) contenait moins d’endotoxines que le lysat de phage véhicule et le lysat de phage T4. Conformément aux instructions de la trousse, les échantillons traités au 1-octanol ont été testés pour l’inhibition du test par l’ajout d’un étalon d’endotoxine au lysat du véhicule (véhicule enrichi), pour donner une concentration finale de 0,5 UE/mL. Les niveaux d’endotoxines des véhicules dopés moins les niveaux d’endotoxines des véhicules étaient de 0,5 UE/mL ±25 %, conformément aux recommandations du fabricant (figure 1B). Cela a démontré que le 1-octanol avait été éliminé avec succès et qu’il n’y avait pas d’inhibition du test causée par les lysats qui pourrait interférer avec les résultats du test.

E. coli Des souris C57BL/6 monocolonisées K-12 (BW25113) ont été élevées dans un isolateur stérile en vinyle à film flexible dans des conditions gnotobiotiques (Figure 2A). Les souris de la génération F0 ont été colonisées par E. coli par son ajout à leur environnement et son cohabitation. Seule la descendance (génération F1 et F2) qui a été colonisée par E. coli dès la naissance par transmission verticale et cohabitation a été utilisée pour les expériences. Cette stratégie contrôlait les changements du système immunitaire, de la production de mucus et du développement du tractus gastro-intestinal qui se produisent en réponse à l’inoculation bactérienne^22,37, permettant ainsi de mesurer les changements qui se produisent uniquement en raison de l’introduction de phages. Une fois matures, les souris expérimentales ont été transférées dans des isocages stériles, où elles ont chacune reçu 2 x 10⁶ pfu de phage T4 ou un volume égal de lysat de véhicule par gavage oral à l’âge de 6 à 8 semaines. L’abondance des phages T4 et d’E. coli a été surveillée pendant quatre semaines par prélèvement de boulettes fécales et des tests d’ensemencement localisé sur gélose à 0,5 % (molle) ou gélose à 1,5 %, respectivement. Au cours de cette expérience, le phage T4 et E. coli ont pu coexister sans que l’une ou l’autre population ne soit épuisée (figure 2B, C). L’administration orale de phage T4 à des doses plus faibles de 2 x 10² et 2 x 10⁴ pfu/souris n’a pas réduit la capacité du phage T4 à coloniser l’intestin par rapport à 2 x 10⁶ pfu (Figure 2D). De même, aucun effet dose-dépendant de l’inoculation de T4 sur les niveaux d’E. coli n’a été observé (figure 2E).

Il est important de noter que la cohérence du placage entre les échantillons s’est avérée cruciale pour le nombre de plaques. Par exemple, lors de l’ajout de bactéries dans la gélose molle, il a été déterminé que la densité des bactéries influençait grandement le résultat du test. L’ajout d’E. coli sous-cultivé pendant 1 h, 1,5 h ou 2 h a entraîné un nombre de plaques inférieur à celui de l’ajout d’E. coli sous-cultivé pendant 2,8 h ou plus. De plus, la quantification de la plaque s’est stabilisée à ~1 x 10⁹ ufp/mL lorsque E. coli a été sous-cultivé pendant 2,8 h à 16 h (pendant la nuit), ce qui représente une augmentation d’environ 5 fois par rapport à la valeur calculée à partir d’une sous-culture de 1 h (~2 x 10⁸ ufp/ml) (figure 3A). Plutôt que de sous-culturer, les bactéries cibles peuvent être inoculées dans une gélose molle à partir de cultures de nuit. Ici, le volume de la culture d’E. coli de 16 h (pendant la nuit) qui a été inoculée dans la gélose molle a eu un impact sur le nombre de plaques (figure 3B). Ces résultats indiquent que la densité d’E. coli dans la gélose peut influencer le nombre de plaques. Dans les deux approches, les résultats de quantification des phages plafonnaient à la même valeur (10⁹ UFP/ml), ce qui suggère que les bactéries cibles doivent être d’une densité suffisamment élevée dans la gélose molle pour assurer la précision du comptage des plaques.

Ensemble, ces résultats soulignent l’importance de développer une compréhension de la cinétique des phages-bactéries par des expériences pilotes in vitro et in vivo avant d’effectuer des manipulations expérimentales.

Figure 1 : Préparation des lysats de phages. (A) Flux de travail pour démarrer un lysat de phages à partir d’un stock de phages à titre élevé. Les lysats ont été propagés, nettoyés, concentrés et les endotoxines ont été éliminées. Le 1-octanol contaminant a été éliminé par vide rapide. (B) Les endotoxines ont été quantifiées dans les lysats de phages et de véhicules à l’aide d’un kit de quantification des endotoxines chromogènes. Les lignes bleues pointillées indiquent les limites supérieure et inférieure pour réfuter l’inhibition du produit dans le contrôle de l’inhibition du produit (0,5 UE/mL ± 25 %). Chaque point représente l’une des deux répliques techniques. La hauteur de la barre représente la moyenne entre les répétitions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Génération de souris monocolonisées et surveillance des niveaux de phages et de bactéries dans les boulettes fécales. (A) Flux de travail pour coloniser des souris exemptes de germes avec une seule espèce bactérienne et génération de souris monocolonisées F1 et F2. (B-E) Les niveaux de phage T4 et d’E. coli détectés dans les boulettes fécales de souris C57BL/6 nées monocolonisées par E. coli et inoculées avec le phage T4 à l’âge de 6 à 8 semaines. Au jour 0 (avant la colonisation) et les jours indiqués après la colonisation, les concentrations de phages en T4 ont été mesurées par placage ponctuel et par analyse sur plaque à l’aide de la méthode de la gélose unique. Les niveaux d’E. coli ont été mesurés par placage ponctuel sur une gélose à 1,5 % de LB. (B, C) Cinétique des niveaux de phage (B) T4 et d’E. coli (C) dans les boulettes fécales récupérées après inoculation avec 2 x 10⁶ pfu de lysat de phage ou de véhicule T4 (normalisé pour le volume et les niveaux d’endotoxines). (D, E) (D) les niveaux de phage T4 et (E) d’E. coli dans les boulettes fécales récupérées après inoculation avec 2 x 10² pfu, 2 x 10⁴ pfu ou 2 x 10⁶ pfu de phage T4. Les barres d’erreur représentent la moyenne et l’erreur type de la moyenne (SEM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Précision du dépannage dans les tests sur plaque. (A) Titre de lysat de phage T4 à l’aide de cultures ou de sous-cultures d’E. coli pendant la nuit pour la préparation d’une gélose molle (gélose à 0,5 %, LB). Des sous-cultures ont été réalisées en utilisant une dilution de 1:50 d’une culture d’E. coli pendant la nuit dans des LB fraîches. 5 mL de préparations de gélose molle ont été inoculées avec 100 μL d’E. coli et 20 μL de phage T4. Le CaCl₂ et le MgSO₄ n’ont pas été ajoutés à la gélose molle pour ces essais, mais peuvent être ajoutés si vous le souhaitez. Les temps de sous-culture d’E. coli inférieurs à 2,8 h ont entraîné une baisse apparente du titre de lysphage. (B) Titre de lysat de phage T4 utilisant différentes densités d’E. coli dans la préparation d’une gélose molle. L’ajout de différents volumes d’E. coli provenant d’une culture de nuit (non sous-cultivée, comme dans A) dans la gélose molle a entraîné des titres de phages apparents différents. Les barres d’erreur représentent l’incertitude calculée du titre de phage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’étude des phages dans le microbiome présente un défi important par rapport à leurs homologues bactériens. Plus précisément, les phages ne contiennent pas de marqueur phylogénétique conservé commun à tous les phages apparenté aux sous-unités ribosomales 16S et 18S qui permettent de faciliter le séquençage et l’identification des espèces procaryotes et eucaryotes, respectivement⁴². Cependant, avec les progrès des approches de séquençage de nouvelle génération, y compris l’augmentation des longueurs de lecture, du débit et la diminution des coûts, vient l’expansion rapide des bases de données génomiques des bactériophages 42,43,44. Avec de nombreux travaux préparatoires sur la découverte de phages bien avancés, la recherche sur les phages est maintenant plus accessible que jamais. En tant que membres clés du microbiome intestinal et organismes les plus diversifiés génétiquement sur Terre, les phages présentent un angle passionnant pour de nouvelles recherches sur la complexité du microbiome. Les protocoles décrits ici se concentrent sur l’étude des espèces de phages connues chez les souris colonisées par leurs bactéries cibles. Il convient de noter que ces protocoles fournissent une ligne directrice pour l’étude des phages in vivo et peuvent être étendus avec la croissance du domaine.

La recherche sur les bactériophages pour le traitement thérapeutique des infections bactériennes est largement passée de mode avec l’avènement des antibiotiques dans les années 1940. Cependant, la surprescription et l’utilisation abusive des antibiotiques ont accéléré l’émergence d’agents pathogènes multirésistants en tant que problème majeur de santé publique³. Les phages présentent une alternative potentielle intéressante aux antibiotiques, en raison de leur haut degré de spécificité de l’hôte³. Il est important de noter que, comme les phages s’installent naturellement en tant que membres du microbiome intestinal humain, il est nécessaire de comprendre d’abord les rôles que jouent les phages dans ces environnements complexes. Bien que de nombreuses études aient examiné la relation entre un phage et sa bactérie cible in vitro, il est important de considérer comment ces relations pourraient se maintenir dans le paysage du tractus gastro-intestinal. Comme dans les études exploratoires portant sur les composants bactériens du microbiote, des modèles murins simplifiés tels que GF et souris monocolonisées permettent d’isoler les effets du phage sur son espèce cible, et comment cette relation contribue à la réponse immunitaire. Il s’agit d’une étape importante vers la phagothérapie, car certains phages peuvent ne pas apporter de bienfaits lorsqu’ils sont introduits dans l’intestin. Par exemple, le phage Pf4 de Pseudomonas aeruginosa exacerbe la maladie causée par son hôte, en inhibant à la fois les réponses immunitaires antibactériennes et la migration des kératinocytes, ce qui entraîne une altération de la cicatrisation des plaies^18,45. Les procédures décrites ici visent à normaliser les techniques d’étude des phages en tant que membres du microbiote murin. Faisant écho à des études pionnières sur l’impact du microbiote sur l’hôte métazoaire, la poursuite des recherches sur les phages dans le contexte du microbiote pourrait s’avérer passionnante et significative pour la compréhension plus large du multibiome⁴⁶.

Limitations
Les protocoles décrits ici ont été optimisés pour étudier la compétition entre le phage T4 et sa bactérie cible, E. coli, lorsque les phages T4 sont administrés par gavage oral à des souris monocolonisées par E. coli. Comme les bactéries, les différentes espèces de phages se comportent différemment les unes des autres, ayant des temps de réplication, des tailles d’éclatement et des gammes de cibles bactériennes variables⁴⁷. Par conséquent, lors de l’étude d’autres paires phage-bactérie dans des modèles animaux similaires, il faut veiller à optimiser ces protocoles à toutes les étapes. Par exemple, les phages ayant un temps de réplication plus long et/ou une taille d’éclat plus petite peuvent nécessiter une incubation plus longue avec leur cible bactérienne pour la production d’un lysat à titre élevé. De même, il peut être nécessaire de prolonger les temps d’incubation sur plaque pour les tests sur plaque. De plus, les phages ayant un temps de réplication court et/ou une taille d’éclatement élevée peuvent nécessiter des incubations sur plaque plus courtes, car l’incubation d’une nuit peut entraîner une prolifération de plaques. Si les conditions de propagation sont inconnues pour un phage d’intérêt spécifique, les bases pour déterminer les conditions de croissance doivent être établies avant de commencer les travaux in vivo ⁴⁸.

Les domaines de type Ig trouvés dans les protéines de capside Hoc du phage T4 facilitent l’adhésion au mucus intestinal¹¹. Selon la capacité de liaison au mucus du phage choisi, la cinétique des concentrations de phages dans les échantillons fécaux peut différer des résultats présentés à la figure 2B-E. Par exemple, il a été démontré dans des systèmes intestin-sur-puce que les phages contenant des protéines Hoc intactes avaient une capacité de destruction accrue d’E. coli par rapport au phage¹¹ déficient en Hoc. Bien que l’on soupçonne que les phages T4 sont retenus par liaison au mucus in vivo 11,12,13, l’impact de la réinoculation par le comportement coprophagique des souris ne peut être exclu. Ces effets pourraient être réduits en utilisant des fonds de cage métallique ou en changeant fréquemment de cage. Étant donné que les domaines de type Ig n’ont pas été identifiés dans les phages d’ADNsb ou d’ARN⁴⁹, il sera intéressant de démêler les autres stratégies utilisées par les phages pour conserver leur résidence dans la muqueuse intestinale.

Enfin, ces études exploratoires ont examiné les interactions phage-bactérie-hôte à l’homéostasie uniquement. Dans les modèles animaux de maladies humaines, on ne sait pas comment les changements dans l’intégrité de la barrière intestinale, comme dans les MII, pourraient avoir un impact sur ces interactions. Des études récentes ont montré que les phages Caudovirales ont augmenté la richesse et la diversité chez les patients atteints de MICI ^7,8. Dans des modèles murins, il a été démontré que le traitement continu par phage exacerbait la colite expérimentale induite par le sulfate de sodium de dextran (DSS)⁸. Il reste à déterminer comment les interactions phage-bactéries-hôte se déroulent dans les environnements inflammatoires, et si l’intégrité altérée de la barrière facilite l’inflammation induite par les phages.

Dépannage et méthodes alternatives

Modèles murins
Les modèles murins monocolonisés permettent d’interroger une seule espèce de bactérie sur la physiologie de l’hôte¹⁶. La recherche impliquant des souris monocolonisées a joué un rôle crucial dans l’élucidation de l’influence du microbiote sur le système immunitaire²². En tant que système modèle, les souris monocolonisées ne récapitulent pas la physiologie de leurs homologues du microbiote conventionnel. Plus semblables aux souris GF, les souris monocolonisées par E. coli ont une production de mucus réduite (similaire aux souris GF⁵⁰) et un système immunitaire immature²³. Cependant, les souris monocolonisées ont été inestimables pour démêler les effets spécifiques des microbes d’espèces individuelles sur le tractus gastro-intestinal et le développement immunitaire. Un exemple classique est la découverte que les bactéries filamenteuses segmentées (SFB) sont de puissants inducteurs des cellules T auxiliaires CD4⁺ 17 chez la souris²⁴. En ce qui concerne le mucus, il existe des effets spécifiques aux microbes sur la transcription du gène du mucus⁵¹et l’épaisseur du mucus⁵⁰. Bien que limitées, les souris monocolonisées offrent des possibilités d’étudier l’impact d’une paire phage-bactérie sur l’hôte mammifère dans un modèle contrôlé. Il est important de noter que les phages peuvent et doivent être étudiés dans le contexte d’un microbiote complexe. Au moment de la rédaction de cet article, peu d’études ont abordé les impacts de la prédation par les phages des espèces bactériennes commensales au sein d’un microbiome conventionnel. Il s’agit d’une application future des protocoles présentés dans cet article, qui pourrait être adaptée pour faciliter ces études.

Utilisation des commandes appropriées du véhicule
Des contrôles appropriés sont essentiels dans toute expérience. Ici, un véhicule approprié pour l’administration orale aux souris a été défini qui contrôle le nettoyage et la purification en plusieurs étapes des lysats de phages T4. Une exigence importante est que le témoin du véhicule contienne un niveau égal d’endotoxines bactériennes que le lysat de phage, pour contrôler toute réponse immunitaire médiée par les endotoxines. Le chloroforme et le 1-octanol sont ajoutés au lysat dans le cadre du processus de purification et éliminés par la suite. Pour contrôler les réponses immunitaires potentielles qui peuvent être générées à l’état de traces de ces produits chimiques, un lysat bactérien sans phages peut être produit comme véhicule de contrôle. Les lysats de phages et de véhicules T4 contenaient une très faible concentration d’endotoxines bactériennes, bien en deçà des niveaux autorisés dans l’eau potable²⁵ (figure 1B). D’autres contrôles peuvent être utilisés et peuvent être modifiés en fonction de la question de recherche prévue. Plus simplement, un tampon de phage contenant une quantité équivalente d’endotoxine peut être utilisé, bien que cela ne tienne pas compte des processus de nettoyage et de purification en plusieurs étapes. Gogokhia et ^al.8ont rapporté l’utilisation d’un phage inactivé par la chaleur comme contrôle pour déterminer si la protéine de phage sans ADN était suffisante pour provoquer une réponse immunitaire. Entre nos mains, le phage inactivé par la chaleur avait des niveaux d’endotoxines inférieurs à ceux du lysat de phage T4 (Figure 1B), et n’a donc pas été utilisé pour contrôler les niveaux d’endotoxines dans cette étude. Cependant, nous encourageons la mise à l’essai des deux protocoles afin de déterminer quelle méthode est la plus appropriée à des fins expérimentales individuelles. Si le véhicule et les lysats de phages T4 diffèrent significativement dans la quantité d’endotoxine présente, le lysat contenant les niveaux les plus faibles peut être complété par de l’endotoxine purifiée. Le 1-octanol est ajouté aux lysats pendant le processus de purification mais inactive le test du kit de quantification des endotoxines chromogènes. Il est important de tester l’inhibition du produit par des substances potentiellement interférentes dans l’échantillon pour s’assurer que les mesures d’endotoxines sont exactes. Si l’on soupçonne une inhibition du produit, il est possible que l’échantillon n’ait pas été aspiré assez longtemps. Si les problèmes persistent, la dialyse peut être utilisée pour éliminer le 1-octanol²⁵ restant.

Voie d’administration et dose
En raison de la capacité de liaison au mucus du phage T4, des modèles murins ont été inoculés en une seule dose orale par gavage. L’objectif était de surveiller la durée de la cohabitation des phages et d’E. coli dans le tractus gastro-intestinal ; cependant, d’autres approches pour étudier les phages dans des modèles in vivo ont été rapportées. Par exemple, l’eau potable enrichie en phages a été utilisée pour fournir un apport continu de phages aux souris ^8,20. L’avantage de cette méthode d’administration est que les phages sont continuellement reconstitués, même en l’absence d’un hôte bactérien, comme l’ont démontré Gogokhia et al.⁸. Ce plan expérimental a permis d’évaluer la réponse immunitaire aux phages en l’absence de bactéries et a fourni une stimulation immunitaire continue au cours de l’expérience. Physiologiquement, cette méthode ne représente pas une évolution naturelle de l’infection par les phages ou de la colonisation par les phages d’un environnement intestinal, mais elle fournit des informations importantes sur la façon dont l’exposition répétée aux phages peut amorcer le système immunitaire. Cela a une importance dans le contexte du développement de la phagothérapie, car les cocktails de phages peuvent être administrés comme traitement pour traiter les infections bactériennes intestinales, similaire aux régimes antibiotiques. Dans le contexte de la paire phage-E. coli T4, il a été déterminé que la diminution de la dose de phage T4 appliquée par voie orale aux souris monocolonisées ne modifiait pas les concentrations fécales de phages ou de bactéries (figures 2D, E). Par conséquent, dans ce cas, la dose d’inoculation du phage T4 n’est pas cruciale pour le maintien d’une colonisation stable par le phage T4-E. coli dans l’intestin des souris bicolonisées. Il est à noter que la dose la plus faible administrée était de 200 ufp/souris et que la dose la plus élevée était de 2 x 10⁶ ufp/souris (selon Hsu et coll.) ². Par conséquent, les données à l’appui de la cinétique des phages-E. coli T4 en dehors de cette plage ne sont pas disponibles dans cette étude.

Titres de phages en tache et en plaque entière
Pour mesurer les niveaux de phages T4 dans les matières fécales et les tissus, les protocoles décrits ici reposent sur des techniques de placage localisé plutôt que sur des tests de plaques entières, ce qui peut contribuer à la variabilité des niveaux de phages entre les souris (Figure 2B). Dans les techniques de plaque entière, les plaques sont comptées sur une plus grande surface, ce qui permet une quantification plus précise. Cependant, une dilution appropriée de chaque échantillon doit généralement être prédéterminée par placage ponctuel. Comme les échantillons ont été analysés le jour du prélèvement, le placage par points a été jugé comme la méthode la plus appropriée pour une approche à plus haut débit. Par conséquent, la résolution de ces données est représentée avec plus de précision par l’ordre de grandeur du phage dans chaque échantillon. Pour des mesures précises des phages, il y a des considérations supplémentaires pour chaque phage. Des mesures plus précises peuvent être obtenues par des tests sur plaque entière ou en utilisant des plages de dilution en série plus petites pour chaque échantillon. Si ces méthodes entraînent toujours des numérations variables de phages ou de bactéries cibles, il serait prudent d’évaluer si des interactions uniques entre le phage et les bactéries pourraient expliquer les différences entre les souris individuelles via le séquençage métagénomique ou d’autres méthodes pour évaluer expérimentalement la coévolution et la résistance. Selon Bonilla et ^al.25, lors de la préparation de la gélose molle pour les essais sur plaque, il est important d’être cohérent avec la quantité d’hôte bactérien ajoutée²⁵. Comme le montre la figure 3, même des changements relativement faibles dans les temps de culture des bactéries (figure 3A) et la densité (figure 3B) peuvent affecter la précision des tests sur plaque. Ces résultats peuvent être différents pour d’autres paires phage-bactérie, et des expériences similaires sont recommandées lorsque l’on commence avec de nouveaux organismes. De plus, pour les nouvelles paires phage-bactérie, des expériences exploratoires doivent être effectuées pour déterminer les caractéristiques de croissance de chacune. Par exemple, des courbes de croissance peuvent être effectuées pour déterminer le décalage, les phases exponentielles et stationnaires et le taux de croissance des bactéries. L’expérience de croissance en une étape peut être utilisée pour déterminer la période de latence (temps de lyse) et la taille de l’éclatement (nombre de phages libérés lors de la lyse bactérienne) des phages^52,53.

Mesure alternative des phages T4 par qPCR
La quantification des phages peut être effectuée par des tests sur plaque, comme indiqué ci-dessus, ou par réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). Ces deux approches présentent une distinction importante : les tests sur plaque déterminent le nombre de phages viables capables d’infecter et de tuer leurs hôtes bactériens, tandis que la qPCR quantifie le matériel génétique spécifique au phage (en tant qu’indicateur du nombre de phages présents) mais ne fournit pas d’informations sur la viabilité et l’infectiosité du phage. Des qPCR ont été effectuées pour comparer la quantification des copies de gènes de phages avec des plaques formées dans des tests de plaques à l’aide d’amorces décrites par Hsu et ^al.2 (Figure 4). L’ADN du phage T4 a été extrait et amplifié du contenu cæcal de souris bicolonisées par le phage/E. coli T4. Chez la plupart des souris, la qPCR et les tests sur plaque ont détecté des niveaux similaires de phage T4 dans le contenu cæcal (Figure 4A, B). Bien qu’une certaine amplification ait été détectée dans le contenu cæcal inoculé par véhicule, les copies de gènes/g calculées étaient inférieures à la limite de détection (LD) (figure 4A). L’absence de phage quantifiable dans ces échantillons a été confirmée par électrophorèse sur gel. Les produits du gène du phage T4 (96 pb) ont été facilement visualisés dans l’ADN isolé du contenu cæcal de souris inoculées à la T4, mais étaient absents des témoins du véhicule (Figure 4C).

Dans ces tests, des copies du gène du phage T4 ont été détectées dans le contenu cæcal d’une souris colonisée par un phage T4 par qPCR (Figure 4A, flèche) malgré l’incapacité de détecter la T4 dans les tests sur plaque du même échantillon (Figure 4B, flèche). Ces résultats suggèrent que des particules virales qui ne forment pas de plaques peuvent apparaître in vivo, soit en raison de la production de particules virales défectueuses, soit de la coévolution des phages et/ou des bactéries. Les techniques de placage bactérien sur gélose dure peuvent être utilisées pour déterminer la sensibilité des bactéries fécales au phage¹⁴. Nous suggérons que la détection médiée par la qPCR peut être un ajout précieux aux flux de travail des phages in vivo , car elle peut être plus robuste à l’évolution des phages dans l’environnement intestinal étant donné qu’elle cible des séquences génétiques courtes et conservées. Les approches non biaisées telles que la métagénomique sont utiles pour examiner la coévolution phage-bactérie et les abondances relatives, mais peuvent finalement être plus coûteuses.

Figure 4 : Détection du phage T 4 par qPCR. (A,B) Les charges de phages en T4 ont été mesurées par (A) qPCR absolue ou (B) test de plaque dans le contenu cæcal de souris C57BL/6 colonisées par E. coli au jour 29 après l’inoculation avec le phage ou le véhicule T4. La flèche indique les résultats d’une souris individuelle qui avait des copies détectables du génome T4 mais pas de virus plaquable dans le contenu cæcal. (C) Électrophorèse sur gel de produits PCR montrant la présence de la bande de 96 pb dans les échantillons cæcaux inoculés par phage T4, mais pas dans les échantillons inoculés par véhicule. Une échelle d’ADN de 100 pb a été utilisée. LOD = limite de détection. Les barres d’erreur représentent la moyenne et le SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Applications
Les bactériophages représentent plus de 90 % des particules pseudo-virales présentes dans le microbiome⁴⁴ ; Cependant, l’impact des phages sur le microbiome intestinal est mal compris. Les premières études portant sur la composante bactérienne du microbiome l’ont fait en isolant des espèces particulières et en étudiant leur impact sur la maturation immunitaire^22,24. Des interrogations similaires sur le phageome présentent une tâche ardue mais nécessaire, et une exigence pour acquérir une compréhension globale du multibiome⁴⁶. Bien que le développement de la phagothérapie ait tendance à être axé sur la guérison des infections bactériennes septiques, il est important de comprendre comment l’ajout d’un cocktail de phages au tractus gastro-intestinal peut modifier l’écosystème intestinal. De plus, l’innocuité des cocktails thérapeutiques de phages doit être évaluée en générant un profil immunitaire. Les phages ont été étudiés comme traitements potentiels pour les infections bactériennes intestinales telles que C. difficile⁵ et le sérovar Typhimurium⁵⁴ de Salmonella enterica. Des études récentes ont également démontré que les FFT sont tout aussi efficaces ou plus efficaces dans le traitement de l’entérocolite nécrosante chez les porcs prématurés⁹, ce qui suggère que la composante virale des greffes de microbiote fécal (FMT) peut jouer un rôle actif dans la réduction de la maladie. Des études continues sur le rôle des phages dans le microbiome sont justifiées pour faire avancer le développement de thérapies par phages contre les agents pathogènes intestinaux, mais aussi pour mieux informer les TMF comme traitement des maladies. En normalisant les méthodes d’étude des phages in vivo, la transparence et la reproductibilité de la recherche sur les phages seront accrues, ainsi que des conseils pour ceux qui étendent leurs travaux à des modèles murins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100