Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein zuverlässiges und effizientes In-vitro-Modell der Blutschranke des Gehirns. Die Methode verwendet zerebrale vaskuläre Endothelzellen der Maus bEnd.3 und misst den elektrischen Widerstand der Transmembran.
Abstract
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine dynamische physiologische Struktur, die aus mikrovaskulären Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten besteht. Durch die Koordination der Wechselwirkung zwischen dem eingeschränkten Transit von Schadstoffen, der Nährstoffaufnahme und der Metaboliten-Clearance im Gehirn ist die BHS für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Zentralnervensystems unerlässlich. Die Erstellung von In-vitro-Modellen der BHS ist ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung der Pathophysiologie neurologischer Erkrankungen und zur Entwicklung pharmakologischer Behandlungen. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Erstellung eines in vitro Monolayer-BHS-Zellmodells durch Aussaat von bEnd.3-Zellen in die obere Kammer einer 24-Well-Platte. Um die Integrität der Zellbarrierefunktion zu beurteilen, wurde das konventionelle Epithelzellvoltmeter verwendet, um den transmembranellen elektrischen Widerstand von normalen Zellen und CoCl 2-induzierten hypoxischen Zellen in Echtzeit aufzuzeichnen. Wir gehen davon aus, dass die oben genannten Experimente effektive Ideen für die Erstellung von In-vitro-Modellen für BHS und Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems liefern werden.
Introduction
BHS ist eine einzigartige biologische Schnittstelle zwischen Blutkreislauf und Nervengewebe, die aus vaskulären Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten, Neuronen und anderen zellulären Strukturen besteht1. Der Fluss von Ionen, Chemikalien und Zellen zwischen Blut und Gehirn wird durch diese Barriere streng reguliert. Diese Homöostase schützt das Nervengewebe vor Toxinen und Krankheitserregern und ermöglicht gleichzeitig die entsprechende Funktion der Nerven des Gehirns 2,3. Die Aufrechterhaltung der Integrität der BHS kann die Entwicklung und das Fortschreiten von Störungen, die das zentrale Nervensystem betreffen, wie z. B. neuronale Dysfunktion, Ödeme und Neuroinflammation, wirksam verhindern4. Die einzigartigen physiologischen Eigenschaften der BHS verhindern jedoch, dass mehr als 98 % der niedermolekularen Medikamente und 100 % der makromolekularen Arzneimittel in das zentrale Nervensystem gelangen5. Daher ist es für die Erzielung der therapeutischen Wirksamkeit unerlässlich, die Penetration von Medikamenten durch die BHS während der Entwicklung von Medikamenten für das zentrale Nervensystem zu erhöhen 6,7. Auch wenn das Computersimulations-Screening von Substraten die Wahrscheinlichkeit, dass Wirkstoffkandidaten die BHS überschreiten, erheblich erhöht hat, werden immer noch zuverlässige und erschwingliche In-vitro-/In-vivo-BHS-Modelle benötigt, um den Anforderungen der wissenschaftlichen Forschung gerecht zu werden8.
Eine schnelle und kostengünstige Technik für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening ist das In-vitro-Modell 9. Um die grundlegenden Prozesse der Auswirkungen von Medikamenten auf die BHS-Funktion und ihre Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krankheiten zu beleuchten, wurde eine Reihe vereinfachter In-vitro-BHS-Modelle erstellt. Gegenwärtig sind die üblichen In-vitro-BHS-Modelle die Monolayer-, Co-Kultur-, dynamischen und mikrofluidischen Modelle 10,11,12, die aus vaskulären Endothelzellen und Astrozyten, Perizyten oder Mikroglia 13,14 aufgebaut sind. Obwohl 3D-Zellkulturen eher der physiologischen Struktur von BHS15 entsprechen, ist ihre Anwendung als Mittel zum Wirkstoffscreening auf BHS immer noch durch ihr kompliziertes Design und ihre unterdurchschnittliche Reproduzierbarkeit eingeschränkt. Im Gegensatz dazu wird das Monolayer-In-vitro-Modell am häufigsten zur Erforschung der BHS verwendet und ist für die Bestimmung der Expression von Membrantransportern und Tight-Junction-Proteinen in bestimmten Zellen geeignet.
Die Messung des elektrischen Transmembranwiderstands (TEER) ist eine Technik zur Bewertung und Überwachung der Zellschicht über dem Widerstand und zur Bewertung der Zellintegrität und Durchlässigkeit der Barriere. Durch gleichzeitiges Einführen von zwei Elektroden in das Wachstumsmedium oder die Pufferlösung auf beiden Seiten der Monoschicht ist es möglich, den Wechselstrom oder die elektrische Impedanz durch die kompakte Schicht16,17 der Zelle zu messen. Um festzustellen, ob das In-vitro-BHS-Modell ordnungsgemäß erstellt wurde, wird in der Regel die Messung der TEER als Goldstandard verwendet18. Auf der anderen Seite kann der Trend der medikamentösen Wirkung auf die BHS-Permeabilität genau vorhergesagt werden, indem die Änderung des elektrischen Widerstands der Zellschicht nach Arzneimittelbeteiligung gemessen wird19. Zum Beispiel entdeckten Feng et al., dass Catalpol (das primäre aktive Monomer von Rehmanniae) die Lipopolysaccharid-induzierte Herunterregulierung von Tight-Junction-Proteinen in der BHS effektiv umkehren und den TEER-Wert der Endothelzellschicht des Mäusegehirns20 erhöhen kann.
Die neuroinflammatorische Reaktion ist in der Regel die Hauptursache für ein Ungleichgewicht der BHS-Homöostase21. Die hypoxische Behandlung zur Induktion neuroinflammatorischer Schäden ist die Hauptmethode zur Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke, hauptsächlich mit physikalischen Methoden und chemischen Reagenzien. Ersteres verwendet in erster Linie einen Drei-Gas-Inkubator, um den Sauerstoffgehalt in der Zellwachstumsumgebung zu variieren, um hypoxische Bedingungen zu simulieren22, während letzteres durch künstliches Einbringen von Desoxyreagenzien wie CoCl2in das Zellkulturmedium23 erreicht wird. Die Zellen bleiben in einem sauerstoffarmen Zustand, wenn Fe2+ durch Co2+ im Häm ersetzt wird. Wenn Fe2+ in der katalytischen Gruppe durch Co2+ ersetzt wird, wird die Aktivität der Prolinhydroxylase und der Aspartathydroxylase gehemmt, was zu einer Akkumulation des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α (HIF-1α)24 führt. Bei anhaltender Hypoxie löst die Dephosphorylierung von HIF-1α im Zytoplasma den Zelltod aus und aktiviert den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, der letztendlich die Gefäßpermeabilität erhöht. In früheren Studien 25,26 wurde gut gezeigt, dass Hypoxie die Expression von endothelialen Tight-Junction-Proteinen signifikant reduzieren kann, um die Permeabilität der BHS zu erhöhen. In dieser Studie wurde die Zeit-Widerstands-Kurve von bEnd.3-Zellen gemessen, die in 24-Well-Platten ausgesät wurden, um ein einfaches BHS-Modell zu erstellen. Mit Hilfe dieses Modells haben wir die Veränderungen der Zell-TEER nach CoCl2-Intervention charakterisiert, um ein Zellmodell zu konstruieren, das für das Screening von Medikamenten auf BHS-Schutz verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Gehirn ist eines der am weitesten entwickelten Körperorgane und steuert eine Vielzahl komplizierter physiologischer Prozesse, darunter Gedächtnis, Kognition, Hören, Riechen und Bewegung27. Das Gehirn ist eines der kompliziertesten und zugleich am meisten erkrankten Organe des menschlichen Körpers. Das Auftreten vieler Erkrankungen des Zentralnervensystems zeigt eine wachsende Tendenz von Jahr zu Jahr, was auf Faktoren wie Luftverschmutzung, unregelmäßiges Essverhalten und andere Faktoren…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir freuen uns über die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Foundation of China (82274207 und 82104533), des Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) und des Xinglin Scholar Research Promotion Project der Chengdu University of TCM (XKTD2022013).
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
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