Регистрация функциональной целостности барьера на клетках эндотелия сосудов bEnd.3 с помощью детектирования трансэндотелиального электрического сопротивления
Summary
Этот протокол описывает надежную и эффективную модель гематоэнцефалического барьера in vitro . Метод использует клетки эндотелия сосудов головного мозга мышей bEnd.3 и измеряет трансмембранное электрическое сопротивление.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) представляет собой динамическую физиологическую структуру, состоящую из микрососудистых эндотелиальных клеток, астроцитов и перицитов. Координируя взаимодействие между ограниченным транзитом вредных веществ, всасыванием питательных веществ и клиренсом метаболитов в головном мозге, ГЭБ играет важную роль в сохранении гомеостаза центральной нервной системы. Построение моделей ГЭБ in vitro является ценным инструментом для изучения патофизиологии неврологических расстройств и создания фармакологических методов лечения. В данном исследовании описана процедура создания модели монослойных клеток ГЭБ in vitro путем посева клеток bEnd.3 в верхнюю камеру 24-луночного планшета. Для оценки целостности барьерной функции клеток использовали обычный эпителиальный клеточный вольтметр для регистрации трансмембранного электрического сопротивления нормальных клеток и CoCl 2-индуцированных гипоксических клеток в режиме реального времени. Мы ожидаем, что вышеуказанные эксперименты дадут эффективные идеи для создания in vitro моделей ГЭБ и препаратов для лечения заболеваний центральной нервной системы.
Introduction
ГЭБ представляет собой уникальный биологический интерфейс между кровообращением и нервной тканью, который состоит из эндотелиальных клеток сосудов, перицитов, астроцитов, нейронов и других клеточных структур1. Поток ионов, химических веществ и клеток между кровью и мозгом строго регулируется этим барьером. Этот гомеостаз защищает нервные ткани от токсинов и болезнетворных микроорганизмов, а также обеспечивает надлежащую работу нервов головного мозга 2,3. Поддержание целостности ГЭБ может эффективно предотвращать развитие и прогрессирование нарушений, влияющих на центральную нервную систему, таких как дисфункция нейронов, отек и нейровоспаление4. Однако уникальные физиологические свойства ГЭБ предотвращают попадание в центральную нервную систему более 98% низкомолекулярных лекарственных препаратов и 100% высокомолекулярных фармацевтических препаратов5. Поэтому увеличение проникновения лекарственных средств через ГЭБ при разработке препаратов для центральной нервной системы имеет существенное значение для достижения терапевтической эффективности 6,7. Несмотря на то, что скрининг субстратов с помощью компьютерного моделирования значительно повысил вероятность того, что кандидаты в лекарственные препараты проникнут через ГЭБ, для удовлетворения потребностейнаучных исследований по-прежнему необходимы надежные и доступные модели ГЭБ in vitro/in vivo.
Быстрым и доступным методом высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов является модель in vitro 9. Для того, чтобы пролить свет на фундаментальные процессы влияния лекарственных средств на функцию ГЭБ и их роль в развитии и прогрессировании заболевания, была создана серия упрощенных моделей ГЭБ in vitro. В настоящее время распространенными моделями ГЭБ in vitro являются монослойные, кокультуральные, динамические и микрофлюидные модели 10,11,12, построенные сосудистыми эндотелиальными клетками и астроцитами, перицитами или микроглией 13,14. Несмотря на то, что 3D-клеточные культуры в большей степени соответствуют физиологической структуре ГЭБ15, их применение в качестве средства скрининга лекарств на ГЭБ по-прежнему ограничено их сложной конструкцией и низкой воспроизводимостью. В отличие от этого, модель монослоя in vitro является наиболее часто используемой для исследования ГЭБ и применима для определения экспрессии мембранных транспортеров и белков плотного соединения в конкретных клетках.
Измерение трансмембранного электрического сопротивления (TEER) — это метод оценки и мониторинга слоя клеток поперек сопротивления, а также оценки целостности клеток и проницаемости барьера. При одновременном введении двух электродов в питательную среду или буферный раствор с обеих сторон монослоя можно измерить переменный ток или электрический импеданс через компактный слой ячейки16,17. Для того, чтобы определить, правильно ли была создана модель ГВВ in vitro, в качестве золотого стандарта обычно используется измерение TEER18. С другой стороны, тенденция действия лекарств на проницаемость ГЭБ может быть точно предсказана путем измерения изменения электрического сопротивления клеточного слоя после введения препарата19. Например, Feng et al. обнаружили, что catalpol (первичный активный мономер rehmanniae) может эффективно обратить вспять вызванную липополисахаридами подавление регуляции белков плотных соединений в ГЭБ и повысить значение TEER20-го слоя эндотелиальных клеток головного мозга мыши.
Нейровоспалительная реакция обычно является основной причиной дисбаланса гомеостаза ГЭБ21. Гипоксическое лечение для индуцирования нейровоспалительного повреждения является основным методом разрушения гематоэнцефалического барьера, в основном включающим физические методы и методы химических реагентов. В первом случае в основном используется инкубатор из трех газов для изменения содержания кислорода в среде роста клеток для моделирования гипоксических условий22, в то время как второй достигается путем искусственного введения дезоксиреагентов, таких как CoCl2, в средуклеточной культуры 23. Клетки останутся в деоксигенированном состоянии, если Fe2+ будет заменен на Co2+ в геме. Если Fe2+ заменить Co2+ в каталитической группе, активность пролингидроксилазы и аспартатгидроксилазы будет ингибирована, что приведет к накоплению гипоксически-индуцируемого фактора-1α (HIF-1α)24. При персистирующей гипоксии дефосфорилирование HIF-1α в цитоплазме вызывает гибель клеток и активирует фактор роста эндотелия сосудов, что в конечном итоге повышает проницаемость сосудов. В предыдущих исследованиях25,26 было хорошо продемонстрировано, что гипоксия может значительно снижать экспрессию эндотелиальных белков плотного соединения для увеличения проницаемости ГЭБ. В этом исследовании была измерена кривая сопротивления времени клеток bEnd.3, засеянных в 24-луночные планшеты, чтобы создать прямолинейную модель ГЭБ. Используя эту модель, мы охарактеризовали изменения в клеточном TEER после вмешательства CoCl2 с целью построения клеточной модели, которая может быть использована для скрининга лекарств на защиту от ГЭБ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Один из наиболее развитых органов тела, мозг контролирует широкий спектр сложных физиологических процессов, включая память, познание, слух, обоняниеи движение. Мозг является одним из самых сложных и больных органов человеческого тела одновременно. Возникновение многих ра…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы высоко ценим финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (82274207 и 82104533), Программы ключевых исследований и разработок Нинся (2023BEG02012) и Проекта содействия научным исследованиям Xinglin Университета ТКМ в Чэнду (XKTD2022013).
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
Referências
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
