Registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale
Summary
Questo protocollo descrive un modello in vitro affidabile ed efficiente della barriera emato-encefalica. Il metodo utilizza cellule endoteliali vascolari cerebrali di topo bEnd.3 e misura la resistenza elettrica transmembrana.
Abstract
La barriera emato-encefalica (BBB) è una struttura fisiologica dinamica composta da cellule endoteliali microvascolari, astrociti e periciti. Coordinando l’interazione tra il transito limitato di sostanze nocive, l’assorbimento dei nutrienti e la clearance dei metaboliti nel cervello, la BBB è essenziale per preservare l’omeostasi del sistema nervoso centrale. La costruzione di modelli in vitro della BBB è uno strumento prezioso per esplorare la fisiopatologia dei disturbi neurologici e creare trattamenti farmacologici. Questo studio descrive una procedura per la creazione di un modello di cellula BBB monostrato in vitro seminando cellule bEnd.3 nella camera superiore di una piastra a 24 pozzetti. Per valutare l’integrità della funzione di barriera cellulare, il voltmetro convenzionale a cellule epiteliali è stato utilizzato per registrare in tempo reale la resistenza elettrica transmembrana delle cellule normali e delle cellule ipossiche indotte da CoCl2. Prevediamo che gli esperimenti di cui sopra forniranno spunti efficaci per la creazione di modelli in vitro di BBB e farmaci per il trattamento dei disturbi delle malattie del sistema nervoso centrale.
Introduction
La BBB è un’interfaccia biologica unica tra la circolazione sanguigna e il tessuto nervoso, composto da cellule endoteliali vascolari, periciti, astrociti, neuroni e altre strutture cellulari1. Il flusso di ioni, sostanze chimiche e cellule tra il sangue e il cervello è strettamente regolato da questa barriera. Questa omeostasi protegge i tessuti nervosi dalle tossine e dagli agenti patogeni, consentendo anche il corretto funzionamento dei nervi cerebrali 2,3. Mantenere l’integrità della BBB può prevenire efficacemente lo sviluppo e la progressione di disturbi che colpiscono il sistema nervoso centrale, come la disfunzione neuronale, l’edema e la neuroinfiammazione4. Tuttavia, le proprietà fisiologiche uniche della BBB impediscono a oltre il 98% dei farmaci a piccole molecole e al 100% dei farmaci macromolecolari di entrare nel sistema nervoso centrale5. Pertanto, aumentare la penetrazione dei farmaci attraverso la BBB durante lo sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale è essenziale per raggiungere l’efficacia terapeutica 6,7. Anche se lo screening con simulazione al computer dei substrati ha aumentato significativamente la probabilità che i candidati farmaci attraversino la BEE, sono ancora necessari modelli di BBB in vitro/in vivo affidabili e convenienti per soddisfare le esigenze della ricerca scientifica8.
Una tecnica rapida ed economica per lo screening dei farmaci ad alto rendimento è il modello in vitro 9. Per far luce sui processi fondamentali degli effetti dei farmaci sulla funzione della BBB e sul loro ruolo nello sviluppo e nella progressione della malattia, è stata creata una serie di modelli semplificati di BBB in vitro. Attualmente, i modelli comuni di BBB in vitro sono i modelli monostrato, di co-coltura, dinamici e microfluidici 10,11,12, costruiti da cellule endoteliali vascolari e astrociti, periciti o microglia 13,14. Sebbene le colture cellulari 3D siano più in linea con la struttura fisiologica della BBB15, la loro applicazione come mezzo di screening farmacologico per la BBB è ancora limitata dal loro design intricato e dalla riproducibilità scadente. Al contrario, il modello monostrato in vitro è quello più frequentemente utilizzato per la ricerca sulla BBB ed è applicabile per determinare l’espressione dei trasportatori di membrana e delle proteine a giunzione stretta in particolari cellule.
La misurazione della resistenza elettrica transmembrana (TEER) è una tecnica per valutare e monitorare lo strato di cellule attraverso la resistenza e valutare l’integrità cellulare e la permeabilità della barriera. Inserendo contemporaneamente due elettrodi nel mezzo di crescita o nella soluzione tampone su entrambi i lati del monostrato, è possibile misurare la corrente alternata o l’impedenza elettrica attraverso lo strato compatto della cella16,17. Al fine di determinare se il modello BBB in vitro è stato creato correttamente, la misurazione del TEER sarà solitamente impiegata come gold standard18. D’altra parte, l’andamento dell’azione dei farmaci sulla permeabilità della BBB può essere previsto con precisione misurando la variazione della resistenza elettrica dello strato cellulare dopo il coinvolgimento del farmaco19. Ad esempio, Feng et al. hanno scoperto che il catalpol (il monomero attivo primario delle rehmanniae) potrebbe invertire efficacemente la down-regulation indotta dai lipopolisaccaridi delle proteine a giunzione stretta nella BBB e aumentare il valore TEER dello strato20 delle cellule endoteliali del cervello di topo.
La risposta neuroinfiammatoria è di solito la causa principale dello squilibrio dell’omeostasi della BBB21. Il trattamento ipossico per indurre lesioni neuroinfiammatorie è il metodo principale per distruggere la barriera emato-encefalica, includendo principalmente metodi fisici e metodi di reagenti chimici. Il primo utilizza principalmente un incubatore a tre gas per variare il contenuto di ossigeno nell’ambiente di crescita cellulare per simulare le condizioni ipossiche22, mentre il secondo si ottiene introducendo artificialmente reagenti deossi come CoCl2 nel terreno di coltura cellulare23. Le cellule rimarranno in una condizione di deossigenazione se Fe2+ viene sostituito con Co2+ nell’eme. Se Fe2+ viene sostituito con Co2+ nel gruppo catalitico, l’attività della prolina idrossilasi e dell’aspartato idrossilasi sarà inibita, con conseguente accumulo di fattore 1α inducibile dall’ipossia (HIF-1α)24. In condizioni di ipossia persistente, la defosforilazione di HIF-1α nel citoplasma innesca la morte cellulare e attiva il fattore di crescita dell’endotelio vascolare, che alla fine aumenta la permeabilità vascolare. In precedenti studi 25,26, è stato ben dimostrato che l’ipossia può ridurre significativamente l’espressione delle proteine endoteliali della giunzione stretta per aumentare la permeabilità della BBB. In questo studio, è stata misurata la curva tempo-resistenza delle cellule bEnd.3 seminate in piastre a 24 pozzetti al fine di creare un modello BBB semplice. Utilizzando questo modello, abbiamo caratterizzato i cambiamenti nel TEER cellulare dopo l’intervento di CoCl2 al fine di costruire un modello cellulare che può essere utilizzato per lo screening dei farmaci per la protezione della BBB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno degli organi corporei più sviluppati, il cervello controlla un’ampia gamma di intricati processi fisiologici, tra cui la memoria, la cognizione, l’udito, l’olfattoe il movimento. Il cervello è uno degli organi più complicati e malati del corpo umano allo stesso tempo. L’insorgenza di molti disturbi del sistema nervoso centrale mostra una tendenza crescente anno dopo anno a causa di fattori quali l’inquinamento atmosferico, i modelli alimentari irregolari e altri fattori 27,28,29.<sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apprezziamo il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (82274207 e 82104533), del Key Research and Development Program di Ningxia (2023BEG02012) e dello Xinglin Scholar Research Promotion Project dell’Università di Chengdu di MTC (XKTD2022013).
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
Referências
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
