Kvalitativ og kvantitativ analyse af siderophorproduktion fra Pseudomonas aeruginosa
Summary
Denne protokol giver både kvalitative og kvantitative analyser af samlede siderophorer, pyoverdin og pyochelin fra Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er kendt for sin produktion af en bred vifte af virulensfaktorer for at etablere infektioner i værten. En sådan mekanisme er rensning af jern gennem siderophorproduktion. P. aeruginosa producerer to forskellige siderophorer: pyochelin, som har lavere jernchelaterende affinitet, og pyoverdin, som har højere jernchelaterende affinitet. Denne rapport viser, at pyoverdin kan kvantificeres direkte fra bakterielle supernatanter, mens pyochelin skal ekstraheres fra supernatanter før kvantificering.
Den primære metode til kvalitativ analyse af siderophorproduktion er Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agarpladeanalyse. I dette assay fører frigivelsen af CAS-farvestof fra Fe3+-farvestofkomplekset til en farveændring fra blå til orange, hvilket indikerer sideropforproduktion. Til kvantificering af det samlede antal siderophorer blev bakterielle supernatanter blandet i lige store mængder med CAS-farvestof i en mikrotiterplade efterfulgt af spektrofotometrisk analyse ved 630 nm. Pyoverdin blev kvantificeret direkte fra bakteriesupernatanten ved at blande den i lige store mængder med 50 mM Tris-HCl efterfulgt af spektrofotometrisk analyse. En top ved 380 nm bekræftede tilstedeværelsen af pyoverdin. Hvad angår pyochelin, var direkte kvantificering fra bakteriesupernatanten ikke mulig, så den måtte først ekstraheres. Efterfølgende spektrofotometrisk analyse afslørede tilstedeværelsen af pyochelin med en top ved 313 nm.
Introduction
Organismer kræver jern til at udføre forskellige vitale funktioner, såsom elektrontransport og DNA-replikation1. Pseudomonas aeruginosa, et gramnegativt opportunistisk patogen, er kendt for at have en række virulensfaktorer for at etablere infektion i værten, blandt hvilke en mekanisme er siderophordannelse2. Under jernnedbrydende forhold frigiver P. aeruginosa specialiserede molekyler kaldet siderophorer, som slukker jern fra det omgivende miljø. Siderophorer chelatjern ekstracellulært, og det resulterende ferric-siderophore-kompleks transporteres aktivt tilbage til cellen3.
P. aeruginosa er kendt for at producere to siderophorer, pyoverdin og pyochelin. Pyoverdin er kendt for at have en højere jernchelaterende affinitet (1:1), mens pyochelin er kendt for at have en mindre jernchelaterende affinitet (2:1)4. Pyochelin kaldes også en sekundær siderophor, fordi den har en lavere jernchelaterende affinitet5. Produktion og regulering af siderophorer styres aktivt af Quorum Sensing (QS) systemer i P. aeruginosa6.
Udover jernslukning er siderophorer også involveret i regulering af virulensfaktorer og spiller en aktiv rolle i biofilmdannelse7. Siderophorer tjener yderligere afgørende roller, herunder involvering i cellesignalering, forsvar mod oxidativ stress og facilitering af interaktioner mellem mikrobielle samfund8. Sideroforer kategoriseres typisk baseret på de specifikke funktionelle grupper, hvorigennem de chelerer jern. De tre primære bidentattestander i denne klassifikation er catecholat, hydroxamat og α-hydroxycarboxylat3. Pyoverdiner er kendetegnende for fluorescerende Pseudomonas-arter som P. aeruginosa og P. fluorescens5. De består af en blandet grøn fluorescerende kromofor koblet til et oligopeptid indeholdende 6-12 aminosyrer. Flere ikke-ribosomale peptidsyntetaser (NRP’er) er involveret i deres syntese9. Fire gener involveret i pyoverdin produktion og regulering er pvdL, pvdI, pvdJ og pvdD10. Pyoverdin er også ansvarlig for infektion og virulens hos pattedyr11. P. aeruginosa er kendt for at producere pyochelin i moderate jernbegrænsende betingelser, mens pyoverdin produceres under alvorlige jernbegrænsende miljøer12. To operoner involveret i pyochelinproduktion er pchDCBA og pchEFGHI13. Det bemærkes, at pyochelin (catecholat) i nærvær af pyocyanin inducerer oxidativ skade og betændelse og genererer hydroxylradikaler, som er skadelige for værtsvæv11.
Chrome Azurol Sulfonate (CAS) assay er bredt vedtaget på grund af dets omfattende, høje følsomhed og større bekvemmelighed sammenlignet med mikrobiologiske assays, som, selvom de er følsomme, kan være alt for specifikke14. CAS-analysen kan udføres på agaroverflader eller i en opløsning. Det er afhængig af den farveændring, der opstår, når jernionen overgår fra sit intense blå kompleks til orange. CAS-kolorimetriet assay kvantificerer udtømningen af jern fra et Fe-CAS-overfladeaktivt ternært kompleks. Dette særlige kompleks, der består af metal, organisk farvestof og overfladeaktivt middel, har en blå farve og udviser en absorptionstop ved 630 nm.
Denne rapport præsenterer en metode til kvalitativ påvisning af siderophorproduktion, hvor man kan detektere produktionen af siderophorer på en agarplade. Der er også tilvejebragt en metode til kvantitativ estimering af den samlede siderophorproduktion i en mikrotiterplade og påvisning og kvantitativ analyse af to siderophorer, pyoverdin og pyochelin, fra P. aeruginosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol gør det muligt for forskere at kvantificere det samlede antal siderophorer og to forskellige siderophorer af P. aeruginosa, nemlig pyoverdin og pyochelin, fra den bakteriecellefrie supernatant. I CAS-agarpladeanalysen danner CAS-farvestof og Fe3+-ioner et kompleks. Når bakterier producerer siderophorer, slukker de Fe3 + ioner fra CAS-Fe3 + komplekset, hvilket fører til en farveændring omkring bakterievæksten. Denne ændring resulterer i en klar orange glorie o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere anerkender finansiering fra DBT – Biotechnology Teaching Program, DBT – BUILDER Program og FIST. MR tak stipendium modtaget fra SHODH. HP takker stipendium modtaget fra CSIR.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Referências
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biologia. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong, , et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
