Análisis cualitativo y cuantitativo de la producción de sideróforos a partir de Pseudomonas aeruginosa

Summary

Este protocolo proporciona análisis cualitativos y cuantitativos de sideróforos totales, pioverdina y pioquelina de Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es conocida por su producción de una amplia gama de factores de virulencia para establecer infecciones en el huésped. Uno de estos mecanismos es la eliminación de hierro a través de la producción de sideróforos. P. aeruginosa produce dos sideróforos diferentes: pioquelina, que tiene menor afinidad quelante del hierro, y pioverdina, que tiene una mayor afinidad quelante del hierro. Este informe demuestra que la pioverdina se puede cuantificar directamente a partir de sobrenadantes bacterianos, mientras que la pioquelina debe extraerse de los sobrenadantes antes de la cuantificación.

El método principal para analizar cualitativamente la producción de sideróforos es el ensayo en placa de agar sulfonato de cromo azurol (CAS). En este ensayo, la liberación del colorante CAS del complejo Fe³⁺-Colorante conduce a un cambio de color de azul a naranja, lo que indica la producción de sideróforos. Para la cuantificación de los sideróforos totales, los sobrenadantes bacterianos se mezclaron en proporciones iguales con colorante CAS en una placa de microtitulación, seguido de un análisis espectrofotométrico a 630 nm. La pioverdina se cuantificó directamente a partir del sobrenadante bacteriano mezclándolo en proporciones iguales con 50 mM de Tris-HCl, seguido de un análisis espectrofotométrico. Un pico a 380 nm confirmó la presencia de pioverdina. En cuanto a la pioquelina, no fue posible la cuantificación directa del sobrenadante bacteriano, por lo que primero hubo que extraerla. El análisis espectrofotométrico posterior reveló la presencia de pioquelina, con un pico a 313 nm.

Introduction

Los organismos requieren hierro para realizar diversas funciones vitales, como el transporte de electrones^{y la} replicación del ADN. Se sabe que Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista gramnegativo, posee una variedad de factores de virulencia para establecer la infección en el huésped, entre los cuales uno de los mecanismos es la formación de sideróforos². Durante las condiciones de agotamiento del hierro, P. aeruginosa libera moléculas especializadas llamadas sideróforos, que apagan el hierro del entorno circundante. Los sideróforos quelan el hierro extracelularmente, y el complejo férrico-sideróforo resultante se transporta activamente de vuelta a la célula³.

Se sabe que P. aeruginosa produce dos sideróforos, pioverdina y piochelina. Se sabe que la pioverdina tiene una mayor afinidad quelante del hierro (1:1), mientras que se sabe que la pioquelina tiene una menor afinidad quelante del hierro (2:1)⁴. La pioquelina también se denomina sideróforo secundario porque tiene una menor afinidad quelante^{de hierro 5}. La producción y regulación de sideróforos se controlan activamente mediante sistemas de detección de quórum (QS) en P. aeruginosa⁶.

Además del enfriamiento del hierro, los sideróforos también están involucrados en la regulación de los factores de virulencia y juegan un papel activo en la formación de biopelículas⁷. Los sideróforos desempeñan funciones cruciales adicionales, incluida la participación en la señalización celular, la defensa contra el estrés oxidativo y la facilitación de las interacciones entre las comunidades microbianas⁸. Los sideróforos generalmente se clasifican en función de los grupos funcionales específicos a través de los cuales quelan el hierro. Los tres ligandos bidentados primarios en esta clasificación son catecolato, hidroxamato y α-hidroxicarboxilato³. Las pioverdinas son características distintivas de especies fluorescentes de Pseudomonas como P. aeruginosa y P. fluorescens⁵. Consisten en un cromóforo fluorescente verde mixto acoplado a un oligopéptido que contiene 6-12 aminoácidos. Varias péptidos sintetasas no ribosómicas (NRPs) están implicadas en su síntesis⁹. Cuatro genes implicados en la producción y regulación de la pioverdina son pvdL, pvdI, pvdJ y pvdD¹⁰. La pioverdina también es responsable de la infección y la virulencia en los mamíferos¹¹. Se observa que P. aeruginosa produce pioquelina en condiciones moderadas de limitación de hierro, mientras que la pioverdina se produce durante ambientes severos de limitación de hierro¹². Dos operones implicados en la producción de pioquelina son pchDCBA y pchEFGHI¹³. Se observa que en presencia de piocianina, la pioquelina (catecolato) induce daño oxidativo e inflamación y genera radicales hidroxilo, que son dañinos para los tejidos del huésped¹¹.

El ensayo de sulfonato de cromo azurol (CAS) es ampliamente adoptado debido a su amplitud, alta sensibilidad y mayor conveniencia en comparación con los ensayos microbiológicos, que, aunque sensibles, pueden ser demasiado específicos¹⁴. El ensayo CAS se puede realizar en superficies de agar o en una solución. Se basa en el cambio de color que se produce cuando el ion férrico pasa de su complejo azul intenso a naranja. El ensayo colorimétrico CAS cuantifica el agotamiento del hierro de un complejo ternario Fe-CAS-surfactante. Este complejo en particular, que consiste en metal, colorante orgánico y tensioactivo, tiene un color azul y exhibe un pico de absorción a 630 nm.

Este informe presenta un método para la detección cualitativa de la producción de sideróforos, donde se puede detectar la producción de sideróforos en una placa de agar. También se proporciona un método para la estimación cuantitativa de la producción total de sideróforos en una placa de microtitulación y la detección y análisis cuantitativo de dos sideróforos, pioverdina y piochelina, de P. aeruginosa.

Protocol

Todos los aislados bacterianos de P. aeruginosa se obtuvieron de laboratorios de microbiología médica de Vadodara y Jaipur, India. Todos los aislados clínicos seleccionados se manipularon en el Gabinete de Bioseguridad (BSL2) y se tuvo sumo cuidado al manipular los aislados bacterianos durante los experimentos. Los detalles comerciales de todos los reactivos/soluciones se proporcionan en la Tabla de Materiales. 1. Preparación del colorante de sulfonato de cromo azur…

Representative Results

Antes de la cuantificación de los sideróforos a partir de aislados clínicos, se llevó a cabo un cribado cualitativo de la producción de sideróforos para garantizar la producción de sideróforos. La detección cualitativa de sideróforos a partir de aislados clínicos se observó mediante el rayado de bacterias en placas de agar CAS. Se seleccionaron tres aislamientos clínicos, a saber, MR1, TL7, J3, junto con PAO1 (la cepa de referencia), para el estudio. Los tres aislados clínic…

Discussion

Este protocolo permite a los investigadores cuantificar los sideróforos totales y dos sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina y pioquelina, a partir del sobrenadante libre de células bacterianas. En el ensayo de placas de agar CAS, el colorante CAS y los iones Fe³⁺ forman un complejo. Cuando las bacterias producen sideróforos, apagan los iones Fe³⁺ del complejo CAS-Fe³⁺, lo que provoca un cambio de color alrededor del crecimiento bacteriano. Este cambio d…

Materials

Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915