Качественный и количественный анализ продукции сидерофоров синегнойной палочки
Summary
Этот протокол обеспечивает как качественный, так и количественный анализ общего количества сидерофоров, пиовердина и пиохелина синегнойной палочки.
Abstract
Синегнойная палочка (P. aeruginosa) известна тем, что вырабатывает разнообразный спектр факторов вирулентности для установления инфекций в организме хозяина. Одним из таких механизмов является поглощение железа путем производства сидерофоров. P. aeruginosa продуцирует два различных сидерофора: пиохелин, который имеет более низкое железо-хелатное сродство, и пиовердин, который имеет более высокое железо-хелатное сродство. Этот отчет демонстрирует, что пиовердин может быть непосредственно количественно определен из бактериальных надосадочных растворов, в то время как пиохелин должен быть извлечен из надосадочной жидкости перед количественным определением.
Основным методом качественного анализа производства сидерофоров является анализ агаровых пластин на основе хром-азурола сульфоната (CAS). В этом анализе высвобождение красителя CAS из комплекса Fe3+-Dye приводит к изменению цвета с синего на оранжевый, что указывает на образование сидерофора. Для количественного определения общего количества сидерофоров бактериальные надосадочные жидкости смешивали в равных пропорциях с красителем CAS в микротитровой пластине с последующим спектрофотометрическим анализом при длине волны 630 нм. Пиовердин определяли непосредственно из бактериальной надосадочной жидкости путем смешивания его в равных пропорциях с 50 мМ Tris-HCl с последующим спектрофотометрическим анализом. Пик на длине волны 380 нм подтвердил наличие пиовердина. Что касается Пиохелина, то прямое количественное определение из бактериальной надосадочной жидкости было невозможно, поэтому его пришлось сначала экстрагировать. Последующий спектрофотометрический анализ выявил присутствие пиохелина с пиком на 313 нм.
Introduction
Организмы нуждаются в железе для выполнения различных жизненно важных функций, таких как перенос электронов ирепликация ДНК. Известно, что Pseudomonas aeruginosa, грамотрицательный условно-патогенный патоген, обладает различными факторами вирулентности для установления инфекции в организме хозяина, одним из механизмов которых является образование сидерофора2. В условиях истощения железа P. aeruginosa высвобождает специализированные молекулы, называемые сидерофорами, которые гасят железо из окружающей среды. Сидерофоры хелатируют железо внеклеточно, и образующийся железо-сидерофорный комплекс активно транспортируется обратно в клетку3.
Известно, что P. aeruginosa продуцирует два сидерофора: пиовердин и пиохелин. Известно, что пиовердин обладает более высоким хелатным сродством железа (1:1), тогда как пиохелин, как известно, имеет меньшее хелатное сродство железа (2:1)4. Пиохелина также называют вторичным сидерофором, потому что он имеет более низкое хелатное сродство железа5. У P. aeruginosa6 производство и регулирование сидерофоров активно контролируется системами Quorum Sensing (QS).
Помимо гашения железа, сидерофоры также участвуют в регуляции факторов вирулентности и играют активную роль в образовании биопленки7. Сидерофоры играют дополнительную важную роль, включая участие в клеточной сигнализации, защите от окислительного стресса и содействии взаимодействию между микробными сообществами8. Сидерофоры обычно классифицируются в зависимости от конкретных функциональных групп, через которые они хелатируют железо. Тремя основными бидентатными лигандами в этой классификации являются катехолат, гидроксамат и α-гидроксикарбоксилат3. Пиовердины являются отличительными признаками флуоресцентных видов Pseudomonas, таких как P. aeruginosa и P. fluorescens5. Они состоят из смешанного зеленого флуоресцентного хромофора, соединенного с олигопептидом, содержащим 6-12 аминокислот. В их синтезе участвуют несколько нерибосомных пептидных синтетаз (NRP)9. Четыре гена, участвующие в производстве и регуляции пиовердина, — это pvdL, pvdI, pvdJ и pvdD10. Пиовердин также отвечает за инфекцию и вирулентность у млекопитающих11. Отмечается, что P. aeruginosa продуцирует пиохелин в условиях умеренного ограничения железа, в то время как пиовердин вырабатывается в тяжелых железолимитирующих средах12. Два оперона, участвующих в выработке пиохелина, — это pchDCBA и pchEFGHI13. Отмечено, что в присутствии пиоцианина пиохелин (катехолаты) индуцирует окислительное повреждение и воспаление и генерирует гидроксильные радикалы, которые вредны для тканей хозяина11.
Анализ на сульфонат азурола хрома (CAS) широко применяется благодаря его полноте, высокой чувствительности и большему удобству по сравнению с микробиологическими анализами, которые, хотя и чувствительны, могут быть чрезмерно специфичными14. Анализ CAS может проводиться на поверхности агара или в растворе. Он основан на изменении цвета, которое происходит, когда ион трехвалентного железа переходит от своего интенсивного синего комплекса к оранжевому. Колориметрический анализ CAS количественно определяет истощение железа из тройного комплекса Fe-CAS-поверхностно-активного вещества. Этот конкретный комплекс, состоящий из металла, органического красителя и поверхностно-активного вещества, имеет синий цвет и демонстрирует пик поглощения на длине волны 630 нм.
В настоящем докладе представлен метод качественного детектирования продукции сидерофоров, при котором можно обнаружить образование сидерофоров на агаровой пластине. Также предложен метод количественной оценки суммарной продукции сидерофоров в микротитровой пластине, а также детекции и количественного анализа двух сидерофоров, пиовердина и пиохелина, из P. aeruginosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол позволяет исследователям количественно определить общее количество сидерофоров и двух различных сидерофоров P. aeruginosa, а именно пиовердина и пиохелина, из бактериальной внеклеточной надосадочной жидкости. В анализе агаровых пластин CAS краситель CAS и ионы Fe3+ обр…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность за финансирование со стороны DBT – Biotechnology Teaching Program, DBT – BUILDER Program и FIST. MR благодарит за стипендию, полученную от SHODH. Компания HP выражает благодарность за стипендию, полученную от CSIR.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Referências
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biologia. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong, , et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
