Pseudomonas aeruginosa'dan Siderofor Üretiminin Kalitatif ve Kantitatif Analizi
Summary
Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa’dan toplam sideroforlar, pyoverdin ve pyochelin’in hem kalitatif hem de kantitatif analizlerini sağlar.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çok çeşitli virülans faktörleri üretmesiyle bilinir. Böyle bir mekanizma, siderofor üretimi yoluyla demirin temizlenmesidir. P. aeruginosa iki farklı siderofor üretir: daha düşük demir şelatlama afinitesine sahip pyochelin ve daha yüksek demir şelatlama afinitesine sahip pyoverdine. Bu rapor, pyoverdin’in bakteriyel süpernatantlardan doğrudan ölçülebildiğini, piyochelin’in ise nicelemeden önce süpernatantlardan ekstrakte edilmesi gerektiğini göstermektedir.
Siderofor üretimini kalitatif olarak analiz etmek için birincil yöntem, Krom Azurol Sülfonat (CAS) agar plakası testidir. Bu tahlilde, Fe3+-Boya kompleksinden CAS boyasının salınması, maviden turuncuya bir renk değişimine yol açarak siderofor üretimini gösterir. Toplam sideroforların miktar tayini için, bakteriyel süpernatantlar bir mikrotitre plakasında CAS boyası ile eşit oranlarda karıştırıldı, ardından 630 nm’de spektrofotometrik analiz yapıldı. Pyoverdine, 50 mM Tris-HCl ile eşit oranlarda karıştırılarak bakteri süpernatantından doğrudan ölçüldü ve ardından spektrofotometrik analiz yapıldı. 380 nm’de bir zirve, pyoverdine’in varlığını doğruladı. Pyochelin’e gelince, bakteriyel süpernatanttan doğrudan miktar tayini mümkün değildi, bu yüzden önce ekstrakte edilmesi gerekiyordu. Daha sonraki spektrofotometrik analiz, 313 nm’de bir tepe noktası ile piyochelin varlığını ortaya çıkardı.
Introduction
Organizmalar, elektron taşınması ve DNA replikasyonu gibi çeşitli hayati işlevleri yerine getirmek için demire ihtiyaç duyar1. Gram-negatif fırsatçı bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa’nın, konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çeşitli virülans faktörlerine sahip olduğu bilinmektedir, bunlardan biri siderofor oluşumudur2. Demir tüketen koşullar sırasında, P. aeruginosa , çevredeki demiri söndüren siderofor adı verilen özel molekülleri serbest bırakır. Sideroforlar demiri hücre dışı olarak şelatlar ve ortaya çıkan ferrik-siderofor kompleksi aktif olarak hücre3’e geri taşınır.
P. aeruginosa’nın iki siderofor, pyoverdine ve pyochelin ürettiği bilinmektedir. Pyoverdinin daha yüksek bir demir şelatlama afinitesine (1:1) sahip olduğu bilinirken, pyochelin’in daha az demir şelatlama afinitesine (2:1) sahip olduğu bilinmektedir4. Pyochelin ayrıca ikincil bir siderofor olarak da adlandırılır çünkü daha düşük bir demir şelatlama afinitesinesahiptir 5. Sideroforların üretimi ve düzenlenmesi, P. aeruginosa6’daki Çekirdek Algılama (QS) sistemleri tarafından aktif olarak kontrol edilmektedir.
Demir söndürmenin yanı sıra, sideroforlar virülans faktörlerinin düzenlenmesinde de rol oynar ve biyofilm oluşumunda aktif rol oynar7. Sideroforlar, hücre sinyalizasyonuna katılım, oksidatif strese karşı savunma ve mikrobiyal topluluklar arasındaki etkileşimlerin kolaylaştırılması dahil olmak üzere ek önemli rollere hizmet eder8. Sideroforlar tipik olarak demiri şelatladıkları spesifik fonksiyonel gruplara göre kategorize edilir. Bu sınıflandırmadaki üç birincil iki dişli ligand, katekolat, hidroksiamat ve α-hidroksikarboksilat3’tür. Pioverdinler, P. aeruginosa ve P. fluorescens5 gibi floresan Pseudomonas türlerinin ayırt edici özellikleridir. 6-12 amino asit içeren bir oligopeptide bağlı karışık bir yeşil floresan kromofordan oluşurlar. Birkaç ribozomal olmayan peptit sentetaz (NRP) sentezlerinde yer alır9. Pioverdin üretimi ve regülasyonunda yer alan dört gen pvdL, pvdI, pvdJ ve pvdD’dir10. Pyoverdine ayrıca memelilerde enfeksiyon ve virülanstan sorumludur11. P. aeruginosa’nın orta derecede demir sınırlayıcı koşullarda pyochelin ürettiği, pyoverdin’in ise şiddetli demir sınırlayıcı ortamlarda üretildiğibelirtilmektedir 12. Pyochelin üretiminde yer alan iki operon pchDCBA ve pchEFGHI13’tür. Piyosiyanin varlığında, piyochelin’in (katekolat) oksidatif hasara ve iltihaplanmaya neden olduğu ve konakçı dokulara zararlı olan hidroksil radikalleri ürettiğibelirtilmektedir 11.
Krom Azurol Sülfonat (CAS) testi, hassas olmasına rağmen aşırı spesifik olabilen mikrobiyolojik tahlillere kıyasla kapsamlılığı, yüksek hassasiyeti ve daha fazla rahatlığı nedeniyle yaygın olarak benimsenmiştir14. CAS testi, agar yüzeylerinde veya bir çözelti içinde gerçekleştirilebilir. Ferrik iyon yoğun mavi kompleksinden turuncuya geçtiğinde meydana gelen renk değişimine dayanır. CAS kolorimetrik testi, bir Fe-CAS-yüzey aktif madde üçlü kompleksinden demirin tükenmesini ölçer. Metal, organik boya ve yüzey aktif maddeden oluşan bu özel kompleks, mavi bir renge sahiptir ve 630 nm’de bir absorpsiyon zirvesi sergiler.
Bu rapor, bir agar plakası üzerinde siderofor üretiminin tespit edilebildiği siderofor üretiminin kalitatif tespiti için bir yöntem sunmaktadır. Bir mikrotitre plakasında toplam siderofor üretiminin kantitatif tahmini ve P. aeruginosa’dan iki sideroforun, pyoverdine ve pyochelin’in tespiti ve kantitatif analizi için bir yöntem de sağlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, araştırmacıların toplam sideroforları ve P. aeruginosa’nın iki farklı sideroforunu, yani pyoverdine ve pyochelin’i, bakteriyel hücresiz süpernatanttan ölçmelerini sağlar. CAS agar plakaları tahlilinde, CAS boyası ve Fe3+ iyonları bir kompleks oluşturur. Bakteriler sideroforlar ürettiğinde, CAS-Fe3+ kompleksinden Fe3+ iyonlarını söndürürler ve bakteri büyümesi etrafında bir renk değişikliğine yol açarlar. Bu değişiklik, bakteri üremesi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, DBT – Biyoteknoloji Öğretim Programı, DBT – BUILDER Programı ve FIST’ten fon aldığını kabul eder. MR teşekkür bursu SHODH’dan alındı. HP, CSIR’den alınan burs sayesinde teşekkür etti.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Referências
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biologia. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong, , et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
