يوفر هذا البروتوكول تحليلات نوعية وكمية لإجمالي siderophores و pyoverdine و pyochelin من Pseudomonas aeruginosa.
تشتهر الزائفة الزنجارية (P. aeruginosa) بإنتاجها لمجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف. إحدى هذه الآليات هي كسح الحديد من خلال إنتاج siderophore. تنتج P. aeruginosa نوعين مختلفين: pyochelin ، الذي لديه تقارب مخلب أقل للحديد ، و pyoverdine ، الذي لديه تقارب مخلب أعلى للحديد. يوضح هذا التقرير أنه يمكن قياس البيوفيردين مباشرة من المواد الطافية البكتيرية ، بينما يحتاج البيوشلين إلى استخلاصه من المواد الطافية قبل القياس الكمي.
الطريقة الأساسية للتحليل النوعي لإنتاج siderophore هي مقايسة لوحة أجار كروم أزورول سلفونات (CAS). في هذا الفحص ، يؤدي إطلاق صبغة CAS من مركب Fe3+-Dye إلى تغيير اللون من الأزرق إلى البرتقالي ، مما يشير إلى إنتاج siderophore. من أجل القياس الكمي للسيدروفورات الكلية ، تم خلط المواد الطافية البكتيرية بنسب متساوية مع صبغة CAS في لوحة عيار ميكروي ، متبوعة بالتحليل الطيفي عند 630 نانومتر. تم قياس Pyoverdine مباشرة من المادة الطافية البكتيرية عن طريق مزجها بنسب متساوية مع 50 mM Tris-HCl ، متبوعا بالتحليل الطيفي. أكدت ذروة عند 380 نانومتر وجود البيوفيردين. أما بالنسبة ل Pyochelin ، فلم يكن القياس الكمي المباشر من الطافية البكتيرية ممكنا ، لذلك كان لا بد من استخراجه أولا. كشف التحليل الطيفي اللاحق عن وجود pyochelin ، مع ذروة عند 313 نانومتر.
تحتاج الكائنات الحية إلى الحديد لأداء وظائف حيوية مختلفة ، مثل نقل الإلكترونات وتضاعف الحمض النووي1. من المعروف أن Pseudomonas aeruginosa ، وهو أحد مسببات الأمراض الانتهازية سالبة الجرام ، يمتلك مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف ، من بينها آلية واحدة هي تكوين siderophore2. خلال ظروف استنفاد الحديد ، تطلق P. aeruginosa جزيئات متخصصة تسمى siderophores ، والتي تروي الحديد من البيئة المحيطة. Siderophores يخلب الحديد خارج الخلية ، ويتم نقل مجمع ferric-siderophore الناتج بنشاط إلى الخلية3.
من المعروف أن P. aeruginosa تنتج اثنين من siderophores ، pyoverdine و pyochelin. من المعروف أن البيوفيردين لديه تقارب مخلب أعلى للحديد (1: 1) ، بينما من المعروف أن البيوشلين له تقارب مخلب أقل للحديد (2: 1) 4. يطلق على Pyochelin أيضا اسم siderophore الثانوي لأنه يحتوي على تقارب مخلب أقل منالحديد 5. يتم التحكم في إنتاج وتنظيم siderophores بنشاط بواسطة أنظمة استشعار النصاب (QS) في P. aeruginosa6.
إلى جانب تبريد الحديد ، تشارك siderophores أيضا في تنظيم عوامل الفوعة وتلعب دورا نشطا في تكوين الأغشية الحيوية7. تخدم Siderophores أدوارا حاسمة إضافية ، بما في ذلك المشاركة في إشارات الخلية ، والدفاع ضد الإجهاد التأكسدي ، وتسهيل التفاعلات بين المجتمعات الميكروبية8. عادة ما يتم تصنيف Siderophores بناء على المجموعات الوظيفية المحددة التي يخلبون من خلالها الحديد. الروابط الثلاثة الأولية في هذا التصنيف هي التصنيف ، والهيدروكسيمات ، و α-هيدروكسي كربوكسيلات3. Pyoverdines هي السمات المميزة لأنواع Pseudomonas الفلورية مثل P. aeruginosa و P. fluorescens5. وهي تتكون من كروموفور فلوري أخضر مختلط مقترن بقليل الببتيد يحتوي على 6-12 من الأحماض الأمينية. تشارك العديد من توليفات الببتيد غير الريبوسومية (NRPs) في تخليقها9. أربعة جينات تشارك في إنتاج وتنظيم البيوفيردين هي pvdL و pvdI و pvdJ و pvdD10. Pyoverdine مسؤول أيضا عن العدوى والفوعة في الثدييات11. يلاحظ أن P. aeruginosa تنتج البيوشلين في ظروف معتدلة تحد من الحديد ، بينما يتم إنتاج البيوفيردين خلال البيئات الشديدة التي تحد من الحديد12. اثنان من الأوبيرونات المشاركة في إنتاج pyochelin هما pchDCBA و pchEFGHI13. تجدر الإشارة إلى أنه في وجود البيوسيانين ، يؤدي البيوشلين (التصنيف) إلى تلف الأكسدة والالتهابات ويولد جذور الهيدروكسيل الضارة بالأنسجة المضيفة11.
تم اعتماد مقايسة كروم أزورول سلفونات (CAS) على نطاق واسع نظرا لشموليتها وحساسيتها العالية وملاءمتها الأكبر مقارنة بالمقايسات الميكروبيولوجية ، والتي ، على الرغم من حساسيتها ، يمكن أن تكون محددة بشكل مفرط14. يمكن إجراء اختبار CAS على أسطح أجار أو في محلول. يعتمد على تغير اللون الذي يحدث عندما ينتقل أيون الحديديك من مركبه الأزرق المكثف إلى اللون البرتقالي. يحدد الفحص اللوني CAS استنفاد الحديد من مركب ثلاثي الفاعل بالسطح Fe-CAS. هذا المركب الخاص ، الذي يتكون من المعدن والصبغة العضوية والسطحي ، له لون أزرق ويظهر ذروة امتصاص عند 630 نانومتر.
يقدم هذا التقرير طريقة للكشف النوعي عن إنتاج siderophore ، حيث يمكن للمرء اكتشاف إنتاج siderophores على لوحة أجار. كما يتم توفير طريقة للتقدير الكمي لإجمالي إنتاج siderophore في لوحة microtiter والكشف والتحليل الكمي لاثنين من siderophores ، pyoverdine و pyochelin ، من P. aeruginosa.
يمكن هذا البروتوكول الباحثين من تحديد إجمالي siderophores واثنين من siderophores مختلفة من P. aeruginosa ، وهما pyoverdine و pyochelin ، من طاف الخلايا البكتيرية الحرة. في مقايسة ألواح أجار CAS ، تشكل صبغة CAS وأيونات Fe3+ معقدا. عندما تنتج البكتيريا siderophores ، فإنها تطفئ أيونات Fe3+ من مركب CAS-Fe3+ ، مما ي?…
The authors have nothing to disclose.
يقر المؤلفون بالتمويل من DBT – برنامج تدريس التكنولوجيا الحيوية ، DBT – برنامج BUILDER و FIST. السيد شكرا الزمالة الواردة من SHODH. HP تشكر الزمالة التي تلقتها من CSIR.
Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
Chloroform | Merck | 1070242521 | |
Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
Citric acid | Merck | 100241 | |
Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
Dichloromethane | Merck | 107020 | |
Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
Sodium chloride | Qualigens | 15915 |