Denne protokol giver både kvalitative og kvantitative analyser af samlede siderophorer, pyoverdin og pyochelin fra Pseudomonas aeruginosa.
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er kendt for sin produktion af en bred vifte af virulensfaktorer for at etablere infektioner i værten. En sådan mekanisme er rensning af jern gennem siderophorproduktion. P. aeruginosa producerer to forskellige siderophorer: pyochelin, som har lavere jernchelaterende affinitet, og pyoverdin, som har højere jernchelaterende affinitet. Denne rapport viser, at pyoverdin kan kvantificeres direkte fra bakterielle supernatanter, mens pyochelin skal ekstraheres fra supernatanter før kvantificering.
Den primære metode til kvalitativ analyse af siderophorproduktion er Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agarpladeanalyse. I dette assay fører frigivelsen af CAS-farvestof fra Fe3+-farvestofkomplekset til en farveændring fra blå til orange, hvilket indikerer sideropforproduktion. Til kvantificering af det samlede antal siderophorer blev bakterielle supernatanter blandet i lige store mængder med CAS-farvestof i en mikrotiterplade efterfulgt af spektrofotometrisk analyse ved 630 nm. Pyoverdin blev kvantificeret direkte fra bakteriesupernatanten ved at blande den i lige store mængder med 50 mM Tris-HCl efterfulgt af spektrofotometrisk analyse. En top ved 380 nm bekræftede tilstedeværelsen af pyoverdin. Hvad angår pyochelin, var direkte kvantificering fra bakteriesupernatanten ikke mulig, så den måtte først ekstraheres. Efterfølgende spektrofotometrisk analyse afslørede tilstedeværelsen af pyochelin med en top ved 313 nm.
Organismer kræver jern til at udføre forskellige vitale funktioner, såsom elektrontransport og DNA-replikation1. Pseudomonas aeruginosa, et gramnegativt opportunistisk patogen, er kendt for at have en række virulensfaktorer for at etablere infektion i værten, blandt hvilke en mekanisme er siderophordannelse2. Under jernnedbrydende forhold frigiver P. aeruginosa specialiserede molekyler kaldet siderophorer, som slukker jern fra det omgivende miljø. Siderophorer chelatjern ekstracellulært, og det resulterende ferric-siderophore-kompleks transporteres aktivt tilbage til cellen3.
P. aeruginosa er kendt for at producere to siderophorer, pyoverdin og pyochelin. Pyoverdin er kendt for at have en højere jernchelaterende affinitet (1:1), mens pyochelin er kendt for at have en mindre jernchelaterende affinitet (2:1)4. Pyochelin kaldes også en sekundær siderophor, fordi den har en lavere jernchelaterende affinitet5. Produktion og regulering af siderophorer styres aktivt af Quorum Sensing (QS) systemer i P. aeruginosa6.
Udover jernslukning er siderophorer også involveret i regulering af virulensfaktorer og spiller en aktiv rolle i biofilmdannelse7. Siderophorer tjener yderligere afgørende roller, herunder involvering i cellesignalering, forsvar mod oxidativ stress og facilitering af interaktioner mellem mikrobielle samfund8. Sideroforer kategoriseres typisk baseret på de specifikke funktionelle grupper, hvorigennem de chelerer jern. De tre primære bidentattestander i denne klassifikation er catecholat, hydroxamat og α-hydroxycarboxylat3. Pyoverdiner er kendetegnende for fluorescerende Pseudomonas-arter som P. aeruginosa og P. fluorescens5. De består af en blandet grøn fluorescerende kromofor koblet til et oligopeptid indeholdende 6-12 aminosyrer. Flere ikke-ribosomale peptidsyntetaser (NRP’er) er involveret i deres syntese9. Fire gener involveret i pyoverdin produktion og regulering er pvdL, pvdI, pvdJ og pvdD10. Pyoverdin er også ansvarlig for infektion og virulens hos pattedyr11. P. aeruginosa er kendt for at producere pyochelin i moderate jernbegrænsende betingelser, mens pyoverdin produceres under alvorlige jernbegrænsende miljøer12. To operoner involveret i pyochelinproduktion er pchDCBA og pchEFGHI13. Det bemærkes, at pyochelin (catecholat) i nærvær af pyocyanin inducerer oxidativ skade og betændelse og genererer hydroxylradikaler, som er skadelige for værtsvæv11.
Chrome Azurol Sulfonate (CAS) assay er bredt vedtaget på grund af dets omfattende, høje følsomhed og større bekvemmelighed sammenlignet med mikrobiologiske assays, som, selvom de er følsomme, kan være alt for specifikke14. CAS-analysen kan udføres på agaroverflader eller i en opløsning. Det er afhængig af den farveændring, der opstår, når jernionen overgår fra sit intense blå kompleks til orange. CAS-kolorimetriet assay kvantificerer udtømningen af jern fra et Fe-CAS-overfladeaktivt ternært kompleks. Dette særlige kompleks, der består af metal, organisk farvestof og overfladeaktivt middel, har en blå farve og udviser en absorptionstop ved 630 nm.
Denne rapport præsenterer en metode til kvalitativ påvisning af siderophorproduktion, hvor man kan detektere produktionen af siderophorer på en agarplade. Der er også tilvejebragt en metode til kvantitativ estimering af den samlede siderophorproduktion i en mikrotiterplade og påvisning og kvantitativ analyse af to siderophorer, pyoverdin og pyochelin, fra P. aeruginosa.
Denne protokol gør det muligt for forskere at kvantificere det samlede antal siderophorer og to forskellige siderophorer af P. aeruginosa, nemlig pyoverdin og pyochelin, fra den bakteriecellefrie supernatant. I CAS-agarpladeanalysen danner CAS-farvestof og Fe3+-ioner et kompleks. Når bakterier producerer siderophorer, slukker de Fe3 + ioner fra CAS-Fe3 + komplekset, hvilket fører til en farveændring omkring bakterievæksten. Denne ændring resulterer i en klar orange glorie o…
The authors have nothing to disclose.
Forfattere anerkender finansiering fra DBT – Biotechnology Teaching Program, DBT – BUILDER Program og FIST. MR tak stipendium modtaget fra SHODH. HP takker stipendium modtaget fra CSIR.
Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
Chloroform | Merck | 1070242521 | |
Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
Citric acid | Merck | 100241 | |
Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
Dichloromethane | Merck | 107020 | |
Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
Sodium chloride | Qualigens | 15915 |