Summary
Dit protocol schetst het gebruik van een op maat ontworpen opnameapparaat en elektroden om lokale veldpotentialen vast te leggen en de informatiestroom in de hippocampus en prefrontale cortex van de muis te onderzoeken.
Abstract
De techniek voor het registreren van lokale veldpotentialen (LFP's) is een elektrofysiologische methode die wordt gebruikt om de elektrische activiteit van gelokaliseerde neuronale populaties te meten. Het dient als een cruciaal hulpmiddel in cognitief onderzoek, met name in hersengebieden zoals de hippocampus en de prefrontale cortex. Dubbele LFP-opnames tussen deze gebieden zijn van bijzonder belang omdat ze de verkenning van interregionale signaalcommunicatie mogelijk maken. Methoden voor het uitvoeren van deze opnames worden echter zelden beschreven, en de meeste commerciële opnameapparaten zijn duur of kunnen niet worden aangepast aan specifieke experimentele ontwerpen. Deze studie presenteert een uitgebreid protocol voor het uitvoeren van LFP-opnames met dubbele elektrode in de hippocampus van de muis en de prefrontale cortex om de effecten van antipsychotica en kaliumkanaalmodulatoren op LFP-eigenschappen in deze gebieden te onderzoeken. De techniek maakt het mogelijk om LFP-eigenschappen te meten, waaronder vermogensspectra binnen elk hersengebied en de samenhang tussen de twee. Bovendien is voor deze experimenten een goedkoop, op maat ontworpen opnameapparaat ontwikkeld. Samenvattend biedt dit protocol een middel om signalen met hoge signaal-ruisverhoudingen in verschillende hersengebieden op te nemen, waardoor het onderzoek naar interregionale informatiecommunicatie binnen de hersenen wordt vergemakkelijkt.
Introduction
Lokale veldpotentialen (LFP's) verwijzen naar de elektrische activiteit die wordt geregistreerd vanuit de extracellulaire ruimte, die de collectieve activiteit van een gelokaliseerde groep neuronen weerspiegelt. Ze vertonen een breed scala aan frequenties, variërend van langzame golven van 1 Hz tot snelle oscillaties van 100 Hz of 200 Hz. Specifieke frequentiebanden zijn in verband gebracht met cognitieve functies zoals leren, geheugen en besluitvorming 1,2. Veranderingen in LFP-eigenschappen zijn gebruikt als biomarkers voor verschillende neurologische aandoeningen, waaronder dementie en schizofrenie 3,4. Het analyseren van LFP-opnames kan waardevolle inzichten bieden in de onderliggende pathologische mechanismen die verband houden met deze aandoeningen en mogelijke therapeutische strategieën.
Dubbele LFP-registratie is een techniek die wordt gebruikt om gelokaliseerde elektrische activiteit binnen en tussen twee specifieke hersengebieden te meten. Deze techniek biedt een waardevolle mogelijkheid om de ingewikkelde neurale dynamiek en signaalcommunicatie te onderzoeken die plaatsvindt binnen en tussen verschillende hersengebieden. Eerdere studies hebben aangetoond dat het detecteren van veranderingen in de neuronale eigenschappen van individuele hersengebieden complex kan zijn, maar veranderingen in interregionale corticale communicatie kunnen worden waargenomen 5,6. Daarom biedt het gebruik van dubbele LFP-opname een krachtig middel om dit probleem aan te pakken.
Hippocampus-prefrontale connectiviteit speelt een cruciale rol bij het moduleren van cognitieve functies en disfunctie is in verband gebracht met verschillende neurologische aandoeningen 7,8. Opnames met dubbele elektroden van deze regio's kunnen informatie geven over deze interacties. Helaas is er beperkte informatie beschikbaar over methoden voor het uitvoeren van LFP-opnames met dubbele elektrode tussen deze gebieden. Bovendien zijn in de handel verkrijgbare opnameapparatuur over het algemeen duur en kunnen ze niet worden aangepast aan specifieke experimentele ontwerpen. De conventionele methode voor het opnemen van LFP's omvat het gebruik van een afgeschermde kabel om het opnameapparaat aan te sluiten op elektroden die in de hersenen van een dier zijn geïmplanteerd. Deze aanpak is echter gevoelig voor bewegingsartefacten en omgevingsruis, wat van invloed is op de kwaliteit en betrouwbaarheid van de opgenomen signalen.
Dit protocol beschrijft een uitgebreide procedure voor het uitvoeren van LFP-opnames met dubbele elektrode in de hippocampus en de prefrontale cortex van de muis, met behulp van een goedkope, op maat ontworpen hoofdtrap die op het hoofd van het dier kan worden geplaatst. Deze methoden stellen onderzoekers in staat om regiospecifieke oscillerende patronen binnen twee afzonderlijke cerebrale regio's te onderzoeken en interregionale informatie-uitwisseling en connectiviteit tussen deze gebieden te verkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Florey Animal Ethics Committee (The University of Melbourne, No. 22-025UM) in overeenstemming met de Australische code voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden. Voor de huidige studie werden C57BL/6 mannelijke muizen (8 weken) gebruikt, verkregen van het Animal Resources Centre (Australië).
1. Headstage ontwerp en fabricage
NOTITIE: De printplaat van de headstage is een compacte vierlaagse printplaat van 14 mm x 12 mm die is ontworpen om direct op de kop van het dier te worden geplaatst. Het maakt gebruik van een commerciële versterkerchip (zie Tabel met materialen) en alle ontwerp- en Gerber-bestanden zijn online beschikbaar (GitHub-link: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- Geef de volgende specificaties door aan de fabrikant: Dikte plaat: 0,6 mm; Minimale tracking/afstand: 4 mils; Minimale gatgrootte: 0,2 mm.
- Volg tijdens het assemblageproces van de printplaat deze volgorde:
- Soldeer de versterkerchip op het bord met behulp van een heteluchtpistool dat is ingesteld op 350 °C.
- Soldeer de passieve componenten.
- Soldeer de SPI-connector en de elektrodeconnector (zie Materiaaltabel).
- Inspecteer het solderen onder een microscoop voor kwaliteitsborging. Zet de SPI-connector op zijn plaats vast met epoxy voor extra stabiliteit.
- Gebruik opnamesoftware van derden en een besturingskaart (zie Materiaaltabel) voor het verkrijgen van signalen. Raadpleeg de gebruikershandleiding van de software voor gedetailleerde instructies.
- De ontworpen headstage ondersteunt 8 kanalen. Schakel in de software de kanalen 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 en 23 in voor opname.
2. Fabricage van elektroden
- Knip PFA-gecoate wolfraamdraden (zie Materiaaltabel) op specifieke lengtes voor verschillende soorten elektroden: prefrontale cortexelektrode (12 mm), hippocampuselektrode (10 mm) en aardelektrode (6 mm).
- Snijd de messing buis (zie Materiaaltabel) in segmenten van 3 mm.
- Verwijder 2 mm van de coating aan het uiteinde van elke draad met een aansteker en soldeer de elektrodedraad vervolgens stevig aan de messing buis. De messing buis heeft een binnendiameter van 0,45 mm en een buitendiameter van 0,60 mm.
- Soldeer voor de massa-elektrode een M1.2 roestvrijstalen schroef (zie Materiaaltabel) aan de elektrode. Breng vloeimiddel op basis van fosforzuur aan op de schroef om het solderen te verbeteren. Reinig de schroef na het solderen met alcohol.
NOTITIE: Draag handschoenen ter bescherming tijdens het soldeerproces.
3. Chirurgische ingreep
- Verdoof de muis in een anesthesiekamer met 3% isofluraan en een zuurstofstroom van 1 l/min.
- Plaats de verdoofde muis op een verwarmingskussen en bevestig deze in een stereotaxisch frame (zie Materiaaltabel).
- Stel de onderhoudssnelheid van isofluraan in op 2,5-3% en verlaag de zuurstofstroom tot 500 ml/min. Controleer met behulp van de teenknijp of het dier nog onder diepe narcose is.
- Injecteer carprofen subcutaan in een dosis van 0,5 mg/kg en breng oogzalf aan ter bescherming van de ogen.
- Scheer en steriliseer het hoofd van de muis met povidonjodium en 80% ethanol.
- Maak een incisie van 8 mm langs de middellijn van de hoofdhuid en verwijder het bindweefsel in het incisiegebied.
- Breng waterstofperoxide aan om het oppervlak van de schedel schoon te maken en zorg ervoor dat u de omliggende huid niet aanraakt.
- Lijn de bregma- en lambda-oriëntatiepunten uit op hetzelfde niveau voor een nauwkeurige plaatsing van de elektrode (bregma en lambda zijn waar de sagittale hechting de coronale en lambdoïde hechtingen snijdt).
- Boor gaten voor referentie-/aardelektrode, ankerschroeven (0.9 mm boorfrees) en actieve elektroden (0.3 mm boorfrees) op gespecificeerde coördinaten.
- Bevestig de op maat gemaakte elektrode (stap 2) aan de stereotaxische framearm en zorg ervoor dat deze loodrecht op de hersenen staat.
- Implanteer de elektrode in het CA1-gebied van de hippocampus (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
OPMERKING: AP, anteroposterieur; ML, mediolateraal; DV, dorsoventraal. - Herhaal de implantatie van de elektrode in de prefrontale cortex (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
- Zet elektroden vast met een in de handel verkrijgbare krachtige lijm en tandheelkundig cement (zie Materiaaltabel).
- Implanteer twee ankerschroeven van 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) om beweging te voorkomen.
- Plaats de referentie-/massa-elektrode in direct contact met de dura mater, 2 mm achter en 2 mm unilateraal ten opzichte van het lambda-oriëntatiepunt.
- Sluit de messing buiszijde van de elektroden aan op een meerkanaals contactdoos (zie Materiaaltabel) met de massa-elektrode in het midden.
- Gebruik krimpkous van 0,8 mm aan de buitenkant van de middelste pen voor isolatie.
- Zet de elektroden, ankerschroeven en connector vast met lijm en tandheelkundig cement.
4. Postoperatieve zorg
- Om postoperatieve pijn te verlichten, injecteert u carprofen in een dosis van 5-10 mg/kg subcutaan elke 12-24 uur op basis van een beoordeling van de pijn gedurende een periode van drie dagen.
- Geef het dier een herstelperiode van een week voordat u met registratie- of experimentele procedures begint.
5. Registratie procedure
- Behandel het dier gedurende 15 minuten, tweemaal daags, gedurende drie opeenvolgende dagen.
- Pak de muizen op door de hand er voorzichtig omheen te sluiten zonder overmatige druk uit te oefenen.
- Plaats het kopstagebord gedurende 30 minuten eenmaal per dag gedurende drie opeenvolgende dagen gedurende 30 minuten op het hoofd van het dier.
- Laat het dier op de opnamedag 30 minuten wennen aan de opnameruimte.
- Plaats het dier in een kleine opnamekamer in een kooi van Faraday om externe elektrische interferentie te verminderen. Sluit de aangepaste headstage aan voor de opname.
- Open de opnamesoftware en selecteer een bemonsteringsfrequentie van 2,00 kHz. Schakel alle kanalen uit, behalve 13 en 20, door elk kanaal te selecteren en op de spatiebalk te drukken.
- Stel in het hardwarebandbreedtevenster de onderste bandbreedte in op 2 Hz en de bovenste bandbreedte op 100 Hz.
- Stel in het softwarefiltervenster het laagdoorlaatfilter in op 100 Hz en het hoogdoorlaatfilter op 2 Hz.
- Kies het opslagpad door te klikken op Selecteer bestandsnaam en klik vervolgens op Opnemen.
- Begin elke opnamesessie met een gewenningsperiode van 10 minuten, gevolgd door een EEG-opname van 15 minuten bij basislijn.
- Na de basisregistratie dient u het geneesmiddel toe via intraperitoneale injectie en gaat u zonder vertraging door met opnemen gedurende nog eens 30 minuten.
OPMERKING: Zie de sectie Resultaten voor de details over de gebruikte medicijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier getoonde resultaten tonen de effecten van verschillende geneesmiddelen op de eigenschappen van lokale veldpotentialen (LFP's) die zijn getest in vier cohorten van C57BL/6 mannelijke muizen (n = 8 voor elk cohort; leeftijd: 8 weken; gewicht: 24,0 ± 0,42 g). De geteste geneesmiddelen omvatten het antipsychoticum clozapine, de kaliumkanaalmodulatoren 4-aminopyridine (4-AP) en retigabine, evenals de zoutoplossing van het controlemedium.
Zoals te zien is in figuur 1, werd de muis in een kleine opnamekamer geplaatst en werden LFP's verzameld uit de hippocampus (HIP) en de prefrontale cortex (PFC) met behulp van een op maat ontworpen hoofdstage. Aangezien deze studie zich voornamelijk richtte op het onderzoek van de theta- en gammafrequentiebanden, onderging het opgenomen signaal eerst een initiële bandpassfiltering binnen een frequentiebereik van 2-100 Hz, gevolgd door bemonstering bij 2000 Hz. Het signaal werd vervolgens opgedeeld in verschillende tijdperken van 2 s. Alle tijdperken die uitgesproken bewegingsartefacten vertoonden, werden geïdentificeerd en vervolgens uitgesloten van daaropvolgende analyseprocessen. Vermogensspectra van LFP's in zowel de HIP en PFC als de HIP-PFC-coherentie werden gemeten met behulp van een multi-taper-gebaseerde analysemethode9. De analyse maakte gebruik van vijf Slepian-conussen en de tijdbandbreedte werd ingesteld op drie om de optimale spectrale concentratie te bereiken. Een schuifvenster van 1 s en een stapgrootte van 100 ms werden gebruikt om de tijd-frequentiespectrogrammen en het tijdsverloop van de HIP-PFC-coherentie te genereren.
Zoals te zien is in figuur 2 en figuur 3, had de toediening van zoutoplossing geen waarneembare effecten op de vermogensspectra van LFP's in HIP en PFC, noch op de HIP-PFC-coherentie. Zowel retigabine als clozapine vertoonden duidelijke verminderingen in het vermogen van de gammaband (30-100 Hz) in HIP en PFC, evenals de coherentie van de gammaband HIP-PFC. Daarentegen vertoonde 4-AP de tegenovergestelde effecten, gekenmerkt door een verhoogd gammabandvermogen in HIP en PFC, samen met een verhoogde coherentie binnen de gammaband tussen HIP en PFC.
Figuur 1: Schema van de experimentele opstelling. Elektroden werden geïmplanteerd in de hippocampus (HIP) en de prefrontale cortex (PFC) voor het registreren van lokale veldpotentialen. Het dier werd in een kleine opnamekamer geplaatst en aan de elektrodeconnector werd een op maat ontworpen hoofdstage bevestigd. Elke opnamesessie begon met een baseline-sessie van 10 minuten, die werd gevolgd door een drugssessie van 30 minuten. De effecten van zoutoplossing, clozapine, 4-AP en retigabine werden getest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De impact van antipsychotica en kaliumkanaalmodulatoren op de voortdurende elektrofysiologische activiteit in de hippocampus (HIP) en prefrontale cortex (PFC). Het genormaliseerde spectrogram van de lokale veldpotentialen in de HIP en PFC, samen met de HIP-PFC-coherentie, vertoonde tijdsafhankelijke effecten voor alle bestudeerde geneesmiddelen. De geneesmiddelen werden toegediend via intraperitoneale injectie op tijdstip t = 15 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De impact van antipsychotica en kaliumkanaalmodulatoren op de vermogensspectradichtheid in HIP en PFC. 4-AP verhoogde de gammabandsterkte aanzienlijk in beide hersengebieden, terwijl clozapine en retigabine de gammabandsterkte in beide regio's onderdrukten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol schetst de procedure voor het construeren van een op maat gemaakte headstage die speciaal is ontworpen voor de gelijktijdige registratie van dubbele lokale veldpotentialen (LFP's) in de hippocampus (HIP) en de prefrontale cortex (PFC). De gedetailleerde stappen in dit protocol bieden voldoende informatie voor onderzoekers om de signaalcommunicatie zowel binnen elke regio als tussen de HIP en PFC grondig te onderzoeken.
De op maat ontworpen headstage maakt gebruik van een commerciële versterkerchip. Hoewel de huidige configuratie de opname van 8 kanalen ondersteunt, kan de headstage eenvoudig worden aangepast om de volledige capaciteit van 32 kanalen te accommoderen, waardoor de mogelijkheid wordt geboden voor een grotere kanaalcapaciteit die geschikt is voor elektrode-array-opname. Gezien de lage kosten van de headstage, is een optie om het bord permanent aan de kop van het dier te bevestigen. Deze aanpak biedt het voordeel van het minimaliseren van bewegingsartefacten en het verminderen van het algehele niveau van verstoring veroorzaakt door beweging.
De op maat gemaakte elektrode demonstreert een stabiele registratie van LFP's op lange termijn, met behoud van een goede signaalkwaliteit over een periode van 3-5 maanden. Een andere haalbare benadering is het gebruik van op polyimide gebaseerde flexibele printplaten als elektrode-arrays10,11. Deze flexibele printplaten kunnen worden geïntegreerd met de opnamestage om meerkanaals opname mogelijk te maken. Deze methode biedt het voordeel dat de voorbereiding van elektroden en chirurgische ingrepen worden vereenvoudigd. Het gewicht van het implantaat met en zonder de headstage is zeer licht, met respectievelijk 0,198 g en 0,812 g, waardoor het geschikt is voor zeer jonge muizen.
Een beperking van de huidige opnametechniek is de mogelijke interferentie veroorzaakt door de ophangkabel, die het natuurlijke gedrag van het dier tijdens experimenten kan verstoren. Om dit probleem aan te pakken, kunnen alternatieve oplossingen worden overwogen, zoals het gebruik van een SD-kaart voor gegevensopslag of het implementeren van een draadloze signaalzendermodule.
Een essentiële en cruciale stap van het protocol is de nauwkeurige positionering van de elektrode. Het is van cruciaal belang om te zorgen voor een nauwkeurige en consistente plaatsing van de elektroden om vergelijkbaarheid tussen experimenten mogelijk te maken. Om de locatie van de elektrode te verifiëren, moet histologie worden uitgevoerd12. Een nuttige techniek om de juiste positionering van de elektrode in de HPC te verbeteren, is door op te nemen terwijl de elektrode verticaal is ingebracht, omdat sterke thètaritmes en neuronaal vuren de juiste plaatsing aangeven. Het is raadzaam om volwassen muizen ouder dan 8 weken te gebruiken, omdat de signaalkwaliteit na verloop van tijd kan afnemen of kan leiden tot een onjuiste plaatsing naarmate de muizen ouder worden. Door rekening te houden met deze overwegingen kunt u de betrouwbaarheid en validiteit van de experimentele resultaten behouden.
Concluderend biedt het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd een kader om de signaalcommunicatie tussen verschillende hersengebieden te bestuderen. Het stelt onderzoekers in staat om de neuronale dynamiek en interacties binnen en tussen deze regio's te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass tube | Albion Alloys, USA | Inside diameter of 0.45 mm | |
| Carprofen | Rimadyl, Pfizer Animal Health | ||
| Commercial amplifier chip | Intantech | RHD 2132 | |
| Control board | Intantech | RHD recording system | |
| Dental cement | Paladur | ||
| Heat shrinks | Panduit | 0.8 mm diameter | |
| M1.2 stainless steel screw | Watch tools | Clock and watch screw | |
| Multichannel socket connector | Harwin, AU | 1.27 mm pitch, PCB socket | |
| PFA-coated tungsten wires | A-M SYSTEMS, USA | Inside diameter of 150 µm | |
| Phosphoric acid-based flux | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| Recording software | Intantech | RHX recording software | |
| Stereotactic Frame | World Precision Instruments | Mouse stereotactic instrument | |
| Super glue | UHU | Ultra fast |
References
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Witton, J., et al. Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia. J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).
- Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings. Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).
- Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. Functional network disruption in the degenerative dementias. Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).
- Sigurdsson, T., Duvarci, S. Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease. Front Syst Neurosci. 9, 190 (2015).
- Sun, D., et al. Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex. Neuropharmacology. 191, 108572 (2021).
- Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. Chronux: A platform for analyzing neural signals. J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).
- Bozkurt, A., Lal, A. Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system. Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).
- Du, P., et al. High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation. Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).
- JoVE Science Education Database. Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue. JoVE. , (2023).
