Summary
Этот протокол описывает использование специально разработанного записывающего устройства и электродов для регистрации потенциалов локального поля и исследования потока информации в гиппокампе мыши и префронтальной коре.
Abstract
Метод регистрации потенциалов локального поля (LFP) представляет собой электрофизиологический метод, используемый для измерения электрической активности локализованных популяций нейронов. Он служит важным инструментом в когнитивных исследованиях, особенно в таких областях мозга, как гиппокамп и префронтальная кора. Двойные записи LFP между этими районами представляют особый интерес, поскольку они позволяют исследовать межрегиональную связь сигналов. Однако методы выполнения этих записей редко описываются, и большинство коммерческих записывающих устройств либо дороги, либо не могут адаптироваться к конкретным экспериментальным конструкциям. В этом исследовании представлен комплексный протокол для выполнения двухэлектродных записей LFP в гиппокампе мыши и префронтальной коре для изучения влияния антипсихотических препаратов и модуляторов калиевых каналов на свойства LFP в этих областях. Этот метод позволяет измерять свойства LFP, включая спектры мощности в каждой области мозга и когерентность между ними. Кроме того, для этих экспериментов было разработано недорогое записывающее устройство, спроектированное по индивидуальному заказу. Таким образом, этот протокол предоставляет средства для записи сигналов с высоким соотношением сигнал/шум в различных областях мозга, облегчая исследование межрегиональной информационной коммуникации в мозге.
Introduction
Локальные потенциалы поля (LFP) относятся к электрической активности, регистрируемой во внеклеточном пространстве, отражающей коллективную активность локализованной группы нейронов. Они демонстрируют разнообразный диапазон частот, охватывающий от медленных волн на частоте 1 Гц до быстрых колебаний на частоте 100 Гц или 200 Гц. Изменения свойств LFP использовались в качестве биомаркеров для различных неврологических расстройств, включая деменцию и шизофрению 3,4. Анализ записей LFP может дать ценную информацию об основных патологических механизмах, связанных с этими состояниями, и потенциальных терапевтических стратегиях.
Двойная запись LFP — это метод, используемый для измерения локализованной электрической активности внутри и между двумя конкретными областями мозга. Этот метод дает ценную возможность исследовать сложную нейронную динамику и передачу сигналов, происходящих внутри и между различными областями мозга. Предыдущие исследования показали, что обнаружение изменений в нейронных свойствах отдельных областей мозга может быть сложным, но изменения в межрегиональной корковой коммуникации могут наблюдаться 5,6. Таким образом, использование двойной записи LFP предлагает мощное средство для решения этой проблемы.
Связь между гиппокампом и префронтальным синдромом играет решающую роль в модуляции когнитивных функций, а дисфункция связана с различными неврологическими расстройствами 7,8. Записи этих областей с двумя электродами могут предоставить информацию об этих взаимодействиях. К сожалению, имеется ограниченная информация о методах выполнения двухэлектродных записей LFP между этими областями. Кроме того, коммерчески доступные записывающие устройства, как правило, дороги и не поддаются адаптации к конкретным экспериментальным конструкциям. Традиционный метод записи LFP включает в себя использование экранированного кабеля для подключения записывающего устройства к электродам, имплантированным в мозг животного. Однако этот подход подвержен артефактам движения и шуму окружающей среды, влияющим на качество и надежность записанных сигналов.
Этот протокол описывает комплексную процедуру выполнения двухэлектродных записей LFP в гиппокампе мыши и префронтальной коре с использованием недорогого специально разработанного головного стола, который может быть размещен на голове животного. Эти методы позволяют исследователям исследовать специфические для региона колебательные паттерны в двух дискретных областях головного мозга и исследовать межрегиональный обмен информацией и связь между этими областями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данное исследование было одобрено Комитетом по этике животных Флори (Мельбурнский университет, No 22-025UM) в соответствии с Австралийским кодексом по уходу за животными и их использованию в научных целях. Для настоящего исследования использовали мышей-самцов C57BL/6 (8 недель), полученных из Центра ресурсов животных (Австралия).
1. Проектирование и изготовление головных сцен
ПРИМЕЧАНИЕ: Печатная плата Headstage представляет собой компактную четырехслойную плату размером 14 мм x 12 мм, предназначенную для размещения непосредственно на голове животного. Он использует коммерческий чип усилителя (см. Таблицу материалов), а все файлы дизайна и Gerber доступны в Интернете (ссылка на GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- Предоставить производителю следующие характеристики: Толщина плиты: 0,6 мм; Минимальное отслеживание/интервал: 4 мила; Минимальный размер отверстия: 0,2 мм.
- В процессе сборки печатной платы следуйте следующему порядку:
- Припаяйте микросхему усилителя к плате с помощью термофена, установленного на 350 °C.
- Припаяйте пассивные компоненты.
- Припаяйте разъем SPI и разъем электрода (см. Таблицу материалов).
- Осмотрите пайку под микроскопом для обеспечения качества. Закрепите разъем SPI на месте с помощью эпоксидной смолы для дополнительной устойчивости.
- Для регистрации сигнала используйте программное обеспечение для записи сторонних производителей и плату управления (см. Таблицу материалов). Подробные инструкции см. в руководстве пользователя программного обеспечения.
- Проектируемая сцена поддерживает 8 каналов. В программном обеспечении включите каналы 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 и 23 для записи.
2. Изготовление электродов
- Отрежьте вольфрамовую проволоку с покрытием PFA (см. Таблицу материалов) до определенной длины для различных типов электродов: префронтального коркового электрода (12 мм), гиппокампа (10 мм) и заземляющего электрода (6 мм).
- Разрежьте латунную трубку (см. Таблицу материалов) на сегменты диаметром 3 мм.
- Удалите 2 мм покрытия на конце каждого провода с помощью зажигалки, затем надежно припаяйте электродную проволоку к латунной трубке. Латунная трубка имеет внутренний диаметр 0,45 мм и внешний диаметр 0,60 мм.
- Для заземляющего электрода припаяйте винт из нержавеющей стали M1.2 (см. Таблицу материалов) к электроду. Нанесите на шнек флюс на основе фосфорной кислоты для улучшения пайки. После пайки очистите винт с помощью спирта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте перчатки для защиты во время процесса пайки.
3. Хирургическое вмешательство
- Анестезируйте мышь в анестезиологической камере с 3% изофлураном и 1 л/мин потоком кислорода.
- Поместите мышь под наркозом на грелку и закрепите ее в стереотаксической рамке (см. Таблицу материалов).
- Отрегулируйте поддерживающую норму изофлурана до 2,5-3% и уменьшите поток кислорода до 500 мл/мин. С помощью зажима пальца ноги убедитесь, что животное все еще находится под глубокой анестезией.
- Подкожно введите карпрофен в дозе 0,5 мг/кг и нанесите глазную мазь для защиты глаз.
- Побрейте и простерилизуйте голову мыши, используя повидон-йод и 80% этанол.
- Сделайте разрез 8 мм по средней линии кожи головы, удалив соединительную ткань в области разреза.
- Нанесите перекись водорода для очистки поверхности черепа, стараясь не задеть окружающую кожу.
- Выровняйте ориентиры брегмы и лямбды на одном уровне для точного размещения электродов (брегма и лямбда — это место, где сагиттальный шов пересекает коронковый и лямбдоидный швы).
- Просверлите отверстия для опорного/заземляющего электрода, анкерных винтов (заусенцы 0,9 мм) и активных электродов (заусенцы 0,3 мм) в заданных координатах.
- Прикрепите изготовленный на заказ электрод (шаг 2) к стереотаксической раме и убедитесь, что он перпендикулярен мозгу.
- Имплантировать электрод в область СА1 гиппокампа (АП – 1,8 мм, МЛ – 1,3 мм, ДВ – 1,4 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: AP, переднезадний; ML, медиолатеральный; DV, дорсовентральный. - Повторная имплантация электродов в префронтальную кору (АП - 2,0 мм, МЛ - 0,3 мм, ДВ - 1,7 мм).
- Закрепите электроды имеющимся в продаже мощным клеем и стоматологическим цементом (см. Таблицу материалов).
- Вживите два анкерных винта 1,2 мм (AP - 1,8 мм, ML -1,6 мм) для предотвращения смещения.
- Расположите электрод сравнения/заземления в прямом контакте с твердой мозговой оболочкой, на расстоянии 2 мм сзади и 2 мм в одностороннем порядке по отношению к ориентиру лямбда-выражения.
- Подсоедините латунную трубку электродов к многоканальному гнездовому разъему (см. Таблицу материалов) с заземляющим электродом посередине.
- Используйте термоусадочную трубку 0,8 мм на внешней стороне среднего штифта для изоляции.
- Закрепите электроды, анкерные винты и соединитель клеем и стоматологическим цементом.
4. Послеоперационный уход
- Для облегчения послеоперационной боли вводят карпрофен в дозе 5-10 мг/кг подкожно каждые 12-24 часа на основании оценки боли в течение трех дней.
- Обеспечьте животному недельный период восстановления, прежде чем начинать какие-либо записи или экспериментальные процедуры.
5. Порядок записи
- Прикасайтесь к животному в течение 15 минут, два раза в день, в течение трех дней подряд.
- Возьмите мышей, осторожно сомкнув их рукой, не оказывая чрезмерного давления.
- Поместите доску для изголовья на голову животного на 30 минут один раз в день в течение трех дней подряд.
- В день записи акклиматизируйте животное в комнате записи в течение 30 минут.
- Поместите животное в небольшую записывающую камеру в клетке Фарадея, чтобы уменьшить внешние электрические помехи. Прикрепите пользовательский пульт для записи.
- Откройте программу записи и выберите частоту дискретизации 2,00 кГц. Отключите все каналы, кроме 13 и 20, выбрав каждый канал и нажав пробел.
- В окне Аппаратная полоса пропускания установите нижнюю полосу пропускания на 2 Гц , а верхнюю полосу пропускания на 100 Гц.
- В окне программной фильтрации настройте фильтр нижних частот на 100 Гц , а фильтр верхних частот на 2 Гц.
- Выберите путь к хранилищу, нажав « Выбрать имя файла», а затем нажмите «Запись».
- Начинайте каждый сеанс записи с 10-минутного периода привыкания, за которым следует 15-минутная базовая запись ЭЭГ.
- После исходной регистрации введите препарат путем внутрибрюшинной инъекции и продолжайте запись в течение дополнительных 30 минут без промедления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об используемых препаратах см. в разделе «Результаты».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Показанные здесь результаты демонстрируют влияние нескольких препаратов на свойства локальных полевых потенциалов (LFP), протестированных в четырех когортах мышей-самцов C57BL/6 (n = 8 для каждой когорты; возраст: 8 недель; вес: 24,0 ± 0,42 г). Тестируемые препараты включали антипсихотический препарат клозапин, модуляторы калиевых каналов 4-аминопиридин (4-AP) и ретигабин, а также контрольный солевой раствор.
Как показано на рисунке 1, мышь помещали в небольшую записывающую камеру, а LFP собирали из гиппокампа (HIP) и префронтальной коры (PFC) с помощью специально разработанной головной сцены. Поскольку это исследование в первую очередь было сосредоточено на изучении диапазонов частот тета и гамма, записанный сигнал сначала подвергался первоначальной полосовой фильтрации в диапазоне частот 2-100 Гц, а затем дискретизации на частоте 2000 Гц. Затем сигнал был разделен на несколько эпох по 2 с. Любые эпохи, демонстрирующие выраженные артефакты движения, были идентифицированы и впоследствии исключены из последующих процессов анализа. Спектры мощности LFP как в HIP, так и в PFC, а также когерентность HIP-PFC были измерены с использованием метода анализа на основе нескольких конусов9. В анализе использовались пять слепианских конусов, а ширина временного диапазона была установлена равной трем для достижения оптимальной спектральной концентрации. Скользящее окно 1 с и размер шага 100 мс использовались для построения частотно-временных спектрограмм и временного хода когерентности HIP-PFC.
Как показано на рисунках 2 и 3, введение физиологического раствора не оказывало заметного влияния на спектры мощности LFP в HIP и PFC, а также на когерентность HIP-PFC. Как ретигабин, так и клозапин продемонстрировали явное снижение мощности гамма-диапазона (30-100 Гц) в HIP и PFC, а также когерентности HIP-PFC гамма-диапазона. Напротив, 4-AP демонстрировал противоположные эффекты, характеризующиеся повышенной мощностью гамма-диапазона в HIP и PFC, наряду с повышенной когерентностью в гамма-диапазоне между HIP и PFC.
Рисунок 1: Схема экспериментальной установки. Электроды были имплантированы в гиппокамп (HIP) и префронтальную кору (PFC) для регистрации локальных полевых потенциалов. Животное было помещено в небольшую записывающую камеру, а специально разработанная головная сцена была прикреплена к разъему электрода. Каждый сеанс записи начинался с 10-минутного базового сеанса, за которым следовал 30-минутный сеанс приема наркотиков. Были проверены эффекты физиологического раствора, клозапина, 4-AP и ретигабина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние антипсихотических препаратов и модуляторов калиевых каналов на текущую электрофизиологическую активность в гиппокампе (HIP) и префронтальной коре (PFC). Нормализованная спектрограмма потенциалов локального поля в HIP и PFC, наряду с когерентностью HIP-PFC, продемонстрировала зависящие от времени эффекты для всех изученных препаратов. Препараты вводились путем внутрибрюшинной инъекции в момент t = 15 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Влияние антипсихотических препаратов и модуляторов калиевых каналов на плотность спектров мощности в HIP и PFC. 4-AP значительно увеличило мощность гамма-диапазона в обеих областях мозга, в то время как клозапин и ретигабин подавили мощность гамма-диапазона в обеих областях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь протокол описывает процедуру создания индивидуальной головной сцены, специально разработанной для одновременной регистрации двойных потенциалов локального поля (LFP) в гиппокампе (HIP) и префронтальной коре (PFC). Подробные шаги, представленные в этом протоколе, дают исследователям достаточно информации для тщательного изучения передачи сигналов как внутри каждой области, так и между HIP и PFC.
В специально разработанной головной сцене используется коммерческий чип усилителя. В то время как текущая конфигурация поддерживает запись 8 каналов, головной каскад может быть легко адаптирован для размещения полной емкости 32 каналов, тем самым обеспечивая потенциал для расширения пропускной способности канала, подходящего для записи электродной решетки. Учитывая низкую стоимость сцены, одним из вариантов является постоянное прикрепление доски к голове животного. Этот подход предлагает преимущество минимизации артефактов движения и снижения общего уровня возмущений, вызванных движением.
Электрод, изготовленный по индивидуальному заказу, демонстрирует стабильную долгосрочную регистрацию LFP, сохраняя хорошее качество сигнала в течение 3-5 месяцев. Другой жизнеспособный подход включает использование гибких печатных плат на основе полиимида в качестве электродных решеток 10,11. Эти гибкие печатные платы могут быть интегрированы с записывающей головкой для обеспечения многоканальной записи. Преимущество этого метода заключается в упрощении подготовки электродов и хирургических процедур. Вес имплантата с головным столиком и без него очень мал — 0,198 г и 0,812 г соответственно, что делает его подходящим для очень молодых мышей.
Одним из ограничений современной техники записи являются потенциальные помехи, вызванные подвешенным кабелем, которые могут помешать естественному поведению животного во время экспериментов. Для решения этой проблемы можно рассмотреть альтернативные решения, такие как использование SD-карты для хранения данных или внедрение модуля беспроводного передатчика сигнала.
Важным и критическим этапом протокола является точное позиционирование электрода. Крайне важно обеспечить точное и последовательное размещение электродов для обеспечения сопоставимости между экспериментами. Для проверки расположения электрода необходимо провести гистологию12. Полезным методом улучшения правильного расположения электродов в HPC является запись, когда электрод вставлен вертикально, так как сильные тета-ритмы и возбуждение нейронов будут указывать на правильное размещение. Рекомендуется использовать взрослых мышей старше 8 недель, так как качество сигнала может со временем ухудшиться или привести к неправильному размещению мышей с возрастом. Учет этих соображений поможет сохранить надежность и обоснованность экспериментальных результатов.
В заключение, протокол, представленный в этой статье, обеспечивает основу для изучения сигнальной связи между различными областями мозга. Это позволяет исследователям исследовать динамику нейронов и взаимодействия внутри и между этими областями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом неврологии Королевской больницы Мельбурна (A2087).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass tube | Albion Alloys, USA | Inside diameter of 0.45 mm | |
| Carprofen | Rimadyl, Pfizer Animal Health | ||
| Commercial amplifier chip | Intantech | RHD 2132 | |
| Control board | Intantech | RHD recording system | |
| Dental cement | Paladur | ||
| Heat shrinks | Panduit | 0.8 mm diameter | |
| M1.2 stainless steel screw | Watch tools | Clock and watch screw | |
| Multichannel socket connector | Harwin, AU | 1.27 mm pitch, PCB socket | |
| PFA-coated tungsten wires | A-M SYSTEMS, USA | Inside diameter of 150 µm | |
| Phosphoric acid-based flux | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| Recording software | Intantech | RHX recording software | |
| Stereotactic Frame | World Precision Instruments | Mouse stereotactic instrument | |
| Super glue | UHU | Ultra fast |
References
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Witton, J., et al. Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia. J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).
- Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings. Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).
- Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. Functional network disruption in the degenerative dementias. Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).
- Sigurdsson, T., Duvarci, S. Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease. Front Syst Neurosci. 9, 190 (2015).
- Sun, D., et al. Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex. Neuropharmacology. 191, 108572 (2021).
- Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. Chronux: A platform for analyzing neural signals. J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).
- Bozkurt, A., Lal, A. Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system. Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).
- Du, P., et al. High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation. Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).
- JoVE Science Education Database. Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue. JoVE. , (2023).
