Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’un appareil d’enregistrement conçu sur mesure et d’électrodes pour enregistrer les potentiels de champ locaux et étudier le flux d’information dans l’hippocampe et le cortex préfrontal de la souris.
Abstract
La technique d’enregistrement des potentiels de champ local (LFP) est une méthode électrophysiologique utilisée pour mesurer l’activité électrique de populations neuronales localisées. Il s’agit d’un outil crucial dans la recherche cognitive, en particulier dans les régions du cerveau comme l’hippocampe et le cortex préfrontal. Les enregistrements LFP doubles entre ces zones sont particulièrement intéressants car ils permettent d’explorer la communication de signaux interrégionaux. Cependant, les méthodes de réalisation de ces enregistrements sont rarement décrites, et la plupart des appareils d’enregistrement commerciaux sont soit coûteux, soit manquent d’adaptabilité pour s’adapter à des modèles expérimentaux spécifiques. Cette étude présente un protocole complet pour effectuer des enregistrements LFP à deux électrodes dans l’hippocampe de la souris et le cortex préfrontal afin d’étudier les effets des médicaments antipsychotiques et des modulateurs des canaux potassiques sur les propriétés LFP dans ces zones. La technique permet de mesurer les propriétés LFP, y compris les spectres de puissance dans chaque région du cerveau et la cohérence entre les deux. De plus, un appareil d’enregistrement peu coûteux et conçu sur mesure a été développé pour ces expériences. En résumé, ce protocole fournit un moyen d’enregistrer des signaux avec des rapports signal/bruit élevés dans différentes régions du cerveau, facilitant ainsi l’étude de la communication interrégionale de l’information dans le cerveau.
Introduction
Les potentiels de champ local (LFP) font référence à l’activité électrique enregistrée à partir de l’espace extracellulaire, reflétant l’activité collective d’un groupe localisé de neurones. Ils présentent une gamme variée de fréquences, allant des ondes lentes à 1 Hz aux oscillations rapides à 100 Hz ou 200 Hz. Des bandes de fréquences spécifiques ont été associées à des fonctions cognitives telles que l’apprentissage, la mémoire et la prise de décision 1,2. Les modifications des propriétés LFP ont été utilisées comme biomarqueurs pour divers troubles neurologiques, notamment la démence et la schizophrénie 3,4. L’analyse des enregistrements LFP peut offrir des informations précieuses sur les mécanismes pathologiques sous-jacents associés à ces conditions et sur les stratégies thérapeutiques potentielles.
L’enregistrement LFP double est une technique utilisée pour mesurer l’activité électrique localisée à l’intérieur et entre deux régions cérébrales spécifiques. Cette technique offre une occasion précieuse d’étudier la dynamique neuronale complexe et la communication des signaux qui se produisent dans et entre des régions cérébrales distinctes. Des études antérieures ont révélé que la détection d’altérations des propriétés neuronales de certaines régions du cerveau peut être complexe, mais des changements dans la communication corticale interrégionale peuvent être observés 5,6. Par conséquent, l’utilisation de l’enregistrement double LFP offre un moyen puissant de résoudre ce problème.
La connectivité hippocampe-préfrontale joue un rôle crucial dans la modulation des fonctions cognitives, et le dysfonctionnement a été lié à divers troubles neurologiques 7,8. L’enregistrement de ces régions à deux électrodes peut fournir des informations sur ces interactions. Malheureusement, il existe peu d’informations disponibles sur les méthodes d’enregistrement LFP à double électrode entre ces zones. De plus, les appareils d’enregistrement disponibles dans le commerce sont généralement coûteux et ne sont pas adaptables à des modèles expérimentaux spécifiques. La méthode conventionnelle d’enregistrement des LFP consiste à utiliser un câble blindé pour connecter l’appareil d’enregistrement à des électrodes implantées dans le cerveau d’un animal. Cependant, cette approche est sensible aux artefacts de mouvement et au bruit environnemental, ce qui a un impact sur la qualité et la fiabilité des signaux enregistrés.
Ce protocole décrit une procédure complète pour effectuer des enregistrements LFP à deux électrodes dans l’hippocampe et le cortex préfrontal de la souris, à l’aide d’un headstage conçu sur mesure à faible coût qui peut être placé sur la tête de l’animal. Ces méthodes permettent aux chercheurs d’étudier des modèles oscillatoires spécifiques à une région dans deux régions cérébrales distinctes et d’explorer l’échange d’informations interrégionales et la connectivité entre ces zones.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique animale de Florey (Université de Melbourne, n° 22-025UM) conformément au code australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques. Des souris mâles C57BL/6 (8 semaines), obtenues auprès de l’Animal Resources Centre (Australie), ont été utilisées pour la présente étude.
1. Conception et fabrication de Headstage
REMARQUE : La carte PCB Headstage est une carte compacte à quatre couches de 14 mm x 12 mm conçue pour être placée directement sur la tête de l’animal. Il utilise une puce d’amplification commerciale (voir la table des matériaux), et tous les fichiers de conception et Gerber sont disponibles en ligne (lien GitHub : https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- Fournir les spécifications suivantes au fabricant : Épaisseur du panneau : 0,6 mm ; Suivi/espacement minimum : 4 mils ; Taille minimale du trou : 0,2 mm.
- Pendant le processus d’assemblage du PCB, suivez cet ordre :
- Soudez la puce de l’amplificateur sur la carte à l’aide d’un pistolet à air chaud réglé à 350 °C.
- Souder les composants passifs.
- Soudez le connecteur SPI et le connecteur de l’électrode (voir tableau des matériaux).
- Inspectez la soudure au microscope pour l’assurance qualité. Fixez le connecteur SPI en place à l’aide d’époxy pour plus de stabilité.
- Utilisez un logiciel d’enregistrement tiers et une carte de contrôle (voir le tableau des matériaux) pour l’acquisition du signal. Reportez-vous au guide d’utilisation du logiciel pour obtenir des instructions détaillées.
- La scène parasite conçue prend en charge 8 canaux. Dans le logiciel, activez les canaux 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 et 23 pour l’enregistrement.
2. Fabrication d’électrodes
- Coupez les fils de tungstène recouverts de PFA (voir le tableau des matériaux) à des longueurs spécifiques pour différents types d’électrodes : électrode du cortex préfrontal (12 mm), électrode de l’hippocampe (10 mm) et électrode de terre (6 mm).
- Coupez le tube en laiton (voir tableau des matériaux) en segments de 3 mm.
- Retirez 2 mm de revêtement à l’extrémité de chaque fil à l’aide d’un briquet, puis soudez solidement le fil de l’électrode au tube en laiton. Le tube en laiton a un diamètre intérieur de 0,45 mm et un diamètre extérieur de 0,60 mm.
- Pour l’électrode de terre, soudez une vis en acier inoxydable M1.2 (voir tableau des matériaux) à l’électrode. Appliquez un flux à base d’acide phosphorique sur la vis pour améliorer la soudure. Après la soudure, nettoyez la vis avec de l’alcool.
REMARQUE : Portez des gants pour vous protéger pendant le processus de soudage.
3. Intervention chirurgicale
- Anesthésie la souris dans une chambre d’anesthésie avec 3 % d’isoflurane et un débit d’oxygène de 1 L/min.
- Placez la souris anesthésiée sur un coussin chauffant et fixez-la dans un cadre stéréotaxique (voir le tableau des matériaux).
- Ajustez le taux d’entretien de l’isoflurane à 2,5-3 % et réduisez le débit d’oxygène à 500 mL/min. À l’aide du pincement des orteils, vérifiez si l’animal est toujours sous anesthésie profonde.
- Injecter par voie sous-cutanée du carprofène à 0,5 mg/kg et appliquer une pommade oculaire pour la protection des yeux.
- Rasez et stérilisez la tête de la souris avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 80 %.
- Faites une incision de 8 mm le long de la ligne médiane du cuir chevelu, en enlevant le tissu conjonctif dans la zone d’incision.
- Appliquez du peroxyde d’hydrogène pour nettoyer la surface du crâne, en faisant attention de ne pas toucher la peau environnante.
- Alignez les repères bregma et lambda au même niveau pour un placement précis des électrodes (bregma et lambda sont l’endroit où la suture sagittale coupe les sutures coronaire et lambdoïde).
- Percez des trous pour l’électrode de référence/de terre, les vis d’ancrage (fraise de perçage de 0,9 mm) et les électrodes actives (fraise de perçage de 0,3 mm) aux coordonnées spécifiées.
- Fixez l’électrode sur mesure (étape 2) au bras du cadre stéréotaxique et assurez-vous qu’elle est perpendiculaire au cerveau.
- Implantez l’électrode dans la zone CA1 de l’hippocampe (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
REMARQUE : AP, antéropostérieur ; ML, médiolatéral ; DV, dorso-ventral. - Implantation répétée d’électrodes dans le cortex préfrontal (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
- Fixez les électrodes avec un adhésif puissant disponible dans le commerce et du ciment dentaire (voir le tableau des matériaux).
- Implantez deux vis d’ancrage de 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML - 1,6 mm) pour éviter tout mouvement.
- Positionnez l’électrode de référence/masse en contact direct avec la dure-mère, de 2 mm en arrière et de 2 mm unilatéralement par rapport au repère lambda.
- Connectez le côté tube en laiton des électrodes à un connecteur multicanal (voir le tableau des matériaux) avec l’électrode de terre au milieu.
- Utilisez une gaine thermorétractable de 0,8 mm à l’extérieur de la goupille centrale pour l’isolation.
- Fixez les électrodes, les vis d’ancrage et le connecteur avec de la colle et du ciment dentaire.
4. Soins postopératoires
- Pour soulager la douleur postopératoire, injectez du carprofène à une dose de 5 à 10 mg/kg par voie sous-cutanée toutes les 12 à 24 heures sur la base d’une évaluation de la douleur pendant une période de trois jours.
- Donnez à l’animal une période de récupération d’une semaine avant de commencer tout enregistrement ou procédure expérimentale.
5. Procédure d’enregistrement
- Manipulez l’animal pendant 15 min, deux fois par jour, pendant trois jours consécutifs.
- Prenez les souris en fermant doucement la main autour d’elles sans appliquer de pression excessive.
- Placez la planche de tête sur la tête de l’animal pendant 30 minutes une fois par jour pendant trois jours consécutifs.
- Le jour de l’enregistrement, acclimatez l’animal à la salle d’enregistrement pendant 30 min.
- Placez l’animal dans une petite chambre d’enregistrement à l’intérieur d’une cage de Faraday pour réduire les interférences électriques externes. Fixez le headstage personnalisé pour l’enregistrement.
- Ouvrez le logiciel d’enregistrement et sélectionnez une fréquence d’échantillonnage de 2,00 kHz. Désactivez tous les canaux à l’exception de 13 et 20 en sélectionnant chaque canal et en appuyant sur la barre d’espace.
- Dans la fenêtre de bande passante matérielle, réglez la bande passante inférieure sur 2 Hz et la bande passante supérieure sur 100 Hz.
- Dans la fenêtre de filtrage du logiciel, réglez le filtre passe-bas sur 100 Hz et le filtre passe-haut sur 2 Hz.
- Choisissez le chemin de stockage en cliquant sur Sélectionner le nom du fichier, puis sur Enregistrer.
- Commencez chaque session d’enregistrement par une période d’habituation de 10 minutes suivie d’un enregistrement EEG de base de 15 minutes.
- Après l’enregistrement de base, administrez le médicament par injection intrapéritonéale et poursuivez l’enregistrement pendant 30 minutes supplémentaires sans délai.
REMARQUE : Voir la section Résultats pour plus de détails sur les médicaments utilisés.
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Representative Results
Les résultats présentés ici démontrent les effets de plusieurs médicaments sur les propriétés des potentiels de champ local (LFP) testés dans quatre cohortes de souris mâles C57BL/6 (n = 8 pour chaque cohorte ; âge : 8 semaines ; poids : 24,0 ± 0,42 g). Les médicaments testés comprenaient l’antipsychotique clozapine, les modulateurs des canaux potassiques 4-aminopyridine (4-AP) et la retigabine, ainsi que le sérum physiologique de contrôle.
Comme le montre la figure 1, la souris a été placée dans une petite chambre d’enregistrement et les LFP ont été prélevés dans l’hippocampe (HIP) et le cortex préfrontal (PFC) à l’aide d’un headstage conçu sur mesure. Comme cette étude s’est principalement concentrée sur l’examen des bandes de fréquences thêta et gamma, le signal enregistré a d’abord subi un filtrage passe-bande initial dans une gamme de fréquences de 2 à 100 Hz, suivi d’un échantillonnage à 2000 Hz. Le signal a ensuite été découpé en plusieurs époques de 2 s. Toutes les époques présentant des artefacts de mouvement prononcés ont été identifiées et par la suite exclues des processus d’analyse ultérieurs. Les spectres de puissance des LFP dans le HIP et le PFC ainsi que la cohérence HIP-PFC ont été mesurés à l’aide d’une méthode d’analyse basée sur des cônes multiples9. L’analyse a utilisé cinq cônes Slepian, et la largeur de bande temporelle a été réglée à trois pour obtenir la concentration spectrale optimale. Une fenêtre glissante de 1 s et une taille de pas de 100 ms ont été utilisées pour générer les spectrogrammes temps-fréquence et l’évolution temporelle de la cohérence HIP-PFC.
Comme le montrent les figures 2 et 3, l’administration de solution saline n’a pas produit d’effets perceptibles sur les spectres de puissance des LFP dans le HIP et le PFC, ni sur la cohérence HIP-PFC. La rétigabine et la clozapine ont toutes deux montré des réductions nettes de la puissance de la bande gamma (30-100 Hz) dans le HIP et le PFC, ainsi que de la cohérence HIP-PFC dans la bande gamma. En revanche, le 4-AP a montré des effets opposés, caractérisés par une augmentation de la puissance de la bande gamma dans le HIP et le PFC, ainsi qu’une cohérence accrue dans la bande gamma entre le HIP et le PFC.
Figure 1 : Schéma du dispositif expérimental. Des électrodes ont été implantées dans l’hippocampe (HIP) et le cortex préfrontal (PFC) pour enregistrer les potentiels de champ locaux. L’animal a été placé dans une petite chambre d’enregistrement, et un étage de tête conçu sur mesure a été fixé au connecteur de l’électrode. Chaque session d’enregistrement a commencé par une séance de base de 10 minutes, suivie d’une séance de drogue de 30 minutes. Les effets de la solution saline, de la clozapine, du 4-AP et de la rétigabine ont été testés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’impact des médicaments antipsychotiques et des modulateurs des canaux potassiques sur l’activité électrophysiologique en cours dans l’hippocampe (HIP) et le cortex préfrontal (PFC). Le spectrogramme normalisé des potentiels de champ locaux dans le HIP et le PFC, ainsi que la cohérence HIP-PFC, ont montré des effets dépendants du temps pour tous les médicaments étudiés. Les médicaments ont été administrés par injection intrapéritonéale à une durée t = 15 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’impact des antipsychotiques et des modulateurs des canaux potassiques sur la densité des spectres de puissance dans le HIP et le PFC. 4-AP a significativement augmenté la puissance de la bande gamma dans les deux régions du cerveau, tandis que la clozapine et la rétigabine ont supprimé la puissance de la bande gamma dans les deux régions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole présenté ici décrit la procédure de construction d’un étage de tête personnalisé spécialement conçu pour l’enregistrement simultané de doubles potentiels de champ local (LFP) dans l’hippocampe (HIP) et le cortex préfrontal (PFC). Les étapes détaillées fournies dans ce protocole offrent suffisamment d’information pour permettre aux chercheurs d’examiner en profondeur la communication des signaux à l’intérieur de chaque région et entre le HIP et le PFC.
Le headstage conçu sur mesure utilise une puce d’amplification commerciale. Alors que la configuration actuelle prend en charge l’enregistrement de 8 canaux, la scène de tête peut être facilement adaptée pour accueillir la pleine capacité de 32 canaux, offrant ainsi la possibilité d’une capacité de canaux étendue adaptée à l’enregistrement sur réseau d’électrodes. Compte tenu du faible coût du headstage, une option consiste à fixer de manière permanente la planche sur la tête de l’animal. Cette approche offre l’avantage de minimiser les artefacts de mouvement et de réduire le niveau global de perturbation causé par le mouvement.
L’électrode fabriquée sur mesure démontre un enregistrement stable à long terme des LFP, maintenant une bonne qualité de signal sur une période de 3 à 5 mois. Une autre approche viable consiste à utiliser des cartes de circuits imprimés flexibles à base de polyimide comme réseaux d’électrodes10,11. Ces circuits imprimés flexibles peuvent être intégrés à la tête d’enregistrement pour permettre l’enregistrement multicanal. Cette méthode offre l’avantage de simplifier la préparation des électrodes et les procédures chirurgicales. Le poids de l’implant avec et sans la tête est très léger, à 0,198 g et 0,812 g, respectivement, ce qui le rend adapté aux très jeunes souris.
L’une des limites de la technique d’enregistrement actuelle est l’interférence potentielle causée par le câble suspendu, qui peut interférer avec le comportement naturel de l’animal pendant les expériences. Pour résoudre ce problème, des solutions alternatives telles que l’utilisation d’une carte SD pour le stockage des données ou la mise en œuvre d’un module émetteur de signal sans fil peuvent être envisagées.
Une étape essentielle et critique du protocole concerne le positionnement précis de l’électrode. Il est crucial d’assurer un placement précis et cohérent des électrodes pour permettre la comparabilité entre les expériences. Pour vérifier l’emplacement de l’électrode, une histologie doit être effectuée12. Une technique utile pour améliorer le positionnement correct de l’électrode dans le HPC consiste à enregistrer pendant que l’électrode est insérée verticalement, car de forts rythmes thêta et une décharge neuronale indiqueront un placement correct. Il est conseillé d’utiliser des souris adultes de plus de 8 semaines, car la qualité du signal peut diminuer avec le temps ou entraîner un placement incorrect à mesure que les souris vieillissent. La prise en compte de ces considérations aidera à maintenir la fiabilité et la validité des résultats expérimentaux.
En conclusion, le protocole présenté dans cet article fournit un cadre pour étudier la communication des signaux entre des régions cérébrales distinctes. Il permet aux chercheurs d’explorer la dynamique neuronale et les interactions au sein et entre ces régions.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass tube | Albion Alloys, USA | Inside diameter of 0.45 mm | |
| Carprofen | Rimadyl, Pfizer Animal Health | ||
| Commercial amplifier chip | Intantech | RHD 2132 | |
| Control board | Intantech | RHD recording system | |
| Dental cement | Paladur | ||
| Heat shrinks | Panduit | 0.8 mm diameter | |
| M1.2 stainless steel screw | Watch tools | Clock and watch screw | |
| Multichannel socket connector | Harwin, AU | 1.27 mm pitch, PCB socket | |
| PFA-coated tungsten wires | A-M SYSTEMS, USA | Inside diameter of 150 µm | |
| Phosphoric acid-based flux | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| Recording software | Intantech | RHX recording software | |
| Stereotactic Frame | World Precision Instruments | Mouse stereotactic instrument | |
| Super glue | UHU | Ultra fast |
References
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Witton, J., et al. Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia. J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).
- Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings. Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).
- Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. Functional network disruption in the degenerative dementias. Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).
- Sigurdsson, T., Duvarci, S. Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease. Front Syst Neurosci. 9, 190 (2015).
- Sun, D., et al. Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex. Neuropharmacology. 191, 108572 (2021).
- Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. Chronux: A platform for analyzing neural signals. J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).
- Bozkurt, A., Lal, A. Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system. Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).
- Du, P., et al. High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation. Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).
- JoVE Science Education Database. Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue. JoVE. , (2023).
