Isolatie van primaire retinale pigmentepitheelcellen van varkens voor in vitro modellering
Summary
Dit protocol schetst de procedure voor het verkrijgen en kweken van primaire retinale pigmentepitheelcellen (RPE) uit lokaal geproduceerde varkensogen. Deze cellen dienen als hoogwaardig alternatief voor stamcellen en zijn geschikt voor in vitro netvliesonderzoek.
Abstract
Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een cruciale monolaag in het buitenste netvlies die verantwoordelijk is voor de ondersteuning van fotoreceptoren. RPE-degeneratie komt vaak voor bij ziekten die worden gekenmerkt door progressief verlies van het gezichtsvermogen, zoals leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD). Onderzoek naar AMD is vaak gebaseerd op menselijke donorogen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) om de RPE weer te geven. Deze RPE-bronnen vereisen echter langere differentiatieperioden en substantiële expertise voor de teelt. Bovendien hebben sommige onderzoeksinstellingen, met name die in landelijke gebieden, geen gemakkelijke toegang tot donorogen. Hoewel er een in de handel verkrijgbare onsterfelijke RPE-cellijn (ARPE-19) bestaat, mist deze essentiële in vivo RPE-kenmerken en wordt deze niet algemeen aanvaard in veel oogheelkundige onderzoekspublicaties. Er is een dringende behoefte om representatieve primaire RPE-cellen te verkrijgen uit een gemakkelijker beschikbare en kosteneffectieve bron. Dit protocol verduidelijkt de isolatie en subcultuur van primaire RPE-cellen die post-mortem zijn verkregen uit varkensogen, die lokaal kunnen worden ingekocht bij commerciële of academische leveranciers. Dit protocol vereist gemeenschappelijke materialen die doorgaans worden aangetroffen in weefselkweeklaboratoria. Het resultaat is een primair, gedifferentieerd en kosteneffectief alternatief voor iPSC’s, menselijke donorogen en ARPE-19-cellen.
Introduction
Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag die zich in het buitenste netvlies bevindt tussen het membraan van Bruch en de fotoreceptoren. RPE-cellen vormen tight junctions met eiwitten zoals zonula occludens-1 (ZO-1) en bezitten een onderscheidend fenotype dat wordt gekenmerkt door pigmentatie en hexagonale morfologie 2,3. Deze cellen dragen bij aan de bloed-retinale barrière, waardoor de gezondheid van de fotoreceptor wordt ondersteund en de homeostase van het netvlies wordt gehandhaafd 4,5. Bovendien spelen RPE-cellen een cruciale rol bij het gezichtsvermogen door licht te absorberen en essentiële componenten voor de fotoreceptoren terecyclen6. RPE65, een eiwit dat sterk tot expressie komt in RPE-cellen, zet bijvoorbeeld all-trans retinylesters om in 11-cis retinol 7,8. Gezien de veelheid aan functies die door RPE-cellen worden uitgevoerd, is hun disfunctie betrokken bij verschillende ziekten, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie en diabetische retinopathie 9,10. Om het begrip van retinale pathologieën te vergroten en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, worden vaak in vitro modellen van het netvlies gebruikt.
Om representatieve modellen van gezonde of zieke netvliezen te genereren, is het absoluut noodzakelijk om een mimetisch RPE-celtype te gebruiken. De in de handel verkrijgbare ARPE-19-cellijn mist inheemse fenotypes, zoals pigmentatie, terwijl het maanden kan duren voordat iPSC’s 11,12,13 onderscheiden. Hoewel menselijke donorogen ideaal kunnen zijn, zijn ze vaak niet direct beschikbaar voor veel onderzoekslaboratoria.
Hier hebben we een methode bedacht om varkensogen, die veel overeenkomsten vertonen met menselijke ogen14, te gebruiken voor het verkrijgen van primaire RPE-cellen. Deze primaire RPE-cellen van varkens zijn gebruikt in meerdere retinale modellen15,16. Deze cellen zijn niet alleen kosteneffectief, maar ze hebben ook minder tijd nodig om te verwerven dan iPSC’s of donorogen. Bovendien vertonen ze inheemse kenmerken, zoals pigmentatie en microvilli. Hoewel er vergelijkbare protocollen voor RPE-extractie bij varkens bestaan 17,18,19, valideert deze eenvoudige en gedetailleerde techniek de enzymatische dissociatie verder en maakt gebruik van materialen die gewoonlijk in de meeste celkweeklaboratoria worden aangetroffen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe RPE-cellen uit varkensogen kunnen worden geïsoleerd. Pigmentatie en geplaveide morfologie worden gezien binnen 7 dagen na isolatie (Figuur 1B). Bovendien duiden TEER-gegevens op tight junction-vorming22 en een gezonde monolaag (figuur 5). Deze resultaten tonen aan dat RPE-cellen die met deze methode zijn geïsoleerd, vergelijkbaar zijn met menselijke RPE en nuttig kunnen zijn in retinale celkweekmodellen.
…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Farhad Farjood bedanken voor zijn hulp bij het kweken en isoleren van RPE-cellen bij varkens en Thomas Harris voor zijn hulp bij SEM. De auteurs erkennen de steun van de Microscopy Core Facility aan de Utah State University voor de SEM-analyse. De faciliteit onderhoudt een scanning-elektronenmicroscoop die is verkregen via een National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Financiering voor deze studie werd verstrekt door een National Institutes of Health via Grant 1R15EY028732 (Vargis) en een BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Aanvullende financiering werd verstrekt door een Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) van het Office of Research van de Utah State University en een startsubsidie (Vargis) van het Alzheimer’s Disease and Dementia Research Center van de Utah State University.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
Referências
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
