In vitroモデリングのための初代ブタ網膜色素上皮細胞の単離
Summary
このプロトコルは局部的に供給されたブタの目から第一次網膜の色素の上皮(RPE)のセルを得、培養するためのプロシージャを概説する。これらの細胞は、幹細胞の高品質な代替品として機能し、 in vitro 網膜研究に適しています。
Abstract
網膜色素上皮(RPE)は、光受容体を支える網膜外部の重要な単層です。RPE変性症は、加齢黄斑変性症(AMD)などの進行性の視力低下を特徴とする疾患で一般的に発生します。AMDの研究は、RPEを表すために、ヒトのドナーの目や人工多能性幹細胞(iPS細胞)に頼ることがよくあります。しかし、これらのRPE源は、培養のための長い分化期間とかなりの専門知識を必要とします。さらに、一部の研究機関、特に農村部では、ドナーの目へのアクセスが容易ではありません。市販の不死化RPE細胞株(ARPE-19)は存在するが、in vivo RPEの本質的な特徴を欠いており、多くの眼科研究出版物では広く受け入れられていない。代表的な一次RPE細胞を、より容易に入手でき、費用対効果の高い供給源から入手することが急務となっています。このプロトコルは商業か学術の製造者から局部的に供給することができるブタの目から死後得られる第一次RPEのセルの隔離そしてsubcultureを解明する。このプロトコルには、組織培養ラボで一般的に見られる一般的な材料が必要です。その結果、iPS細胞、ヒトドナー眼球、ARPE-19細胞に代わる、分化型で費用対効果の高い一次代替細胞が誕生しました。
Introduction
網膜色素上皮(RPE)は、ブルッフ膜と視細胞1の間の網膜外に位置する単層である。RPE細胞は、閉塞帯帯-1(ZO-1)などのタンパク質とタイトジャンクションを形成し、色素沈着と六角形の形態を特徴とする独特の表現型を持っています2,3。これらの細胞は血液網膜関門に寄与し、それによって視細胞の健康をサポートし、網膜の恒常性を維持します4,5。さらに、RPE細胞は、光を吸収し、光受容体に不可欠な成分をリサイクルすることにより、視覚において重要な役割を果たします6。例えば、RPE細胞で高発現するタンパク質であるRPE65は、オールトランスレチニルエステルを11-シスレチノール7,8に変換します。RPE細胞が果たす機能の多さを考えると、その機能不全は、加齢黄斑変性症や糖尿病性網膜症などのさまざまな疾患に関与しています9,10。網膜の病状の理解を深め、新しい治療法を開発するために、網膜のin vitroモデルが頻繁に採用されています。
健康な網膜または病気の網膜の代表的なモデルを生成するには、模倣RPE細胞タイプを使用することが不可欠です。市販のARPE-19細胞株は、色素沈着などの天然表現型を欠いていますが、iPS細胞は11,12,13を分化するのに数ヶ月かかることがあります。ヒトのドナーの目は理想的かもしれませんが、多くの研究室ではすぐには入手できないことがよくあります。
ここでは、ヒトの目と多くの類似点を持つブタの目14を利用して、初代RPE細胞を得る方法を考案した。これらの初代ブタRPE細胞は、複数の網膜モデルで利用されている15,16。これらの細胞は費用対効果が高いだけでなく、iPS細胞やドナーの眼球よりも取得に要する時間が短くて済みます。さらに、色素沈着や微絨毛などの天然の特徴を示します。ブタRPE抽出のための同様のプロトコルが存在しますが17,18,19、この単純で詳細な技術は、酵素解離をさらに検証し、ほとんどの細胞培養ラボで一般的に見られる材料を採用しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルはブタの目からRPEのセルを隔離する方法を記述する。色素沈着と丸石の形態は、分離後7日以内に見られます(図1B)。さらに、TEERデータは、タイトジャンクション形成22 と健全な単層を示しています(図5)。これらの結果は、この方法で単離されたRPE細胞がヒトRPEに類似しており、網膜細胞培養モデルにおいて有益で?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ブタRPE細胞の培養と単離に協力してくれたFarhad Farjood氏と、SEMを支援してくれたThomas Harris氏に感謝します。著者らは、ユタ州立大学の顕微鏡コア施設からのSEM分析のサポートに感謝しています。この施設では、米国国立科学財団のMajor Research Instrumentation Grant(CMMI-1337932)から取得した走査型電子顕微鏡が維持されています。この研究の資金は、米国国立衛生研究所(NIH)から助成金1R15EY028732(Vargis)およびBrightFocus Foundation助成金M2019109(Vargis)を通じて提供されました。追加の資金は、ユタ州立大学研究局からの学部研究および創造的機会助成金(ウェザーストン)と、ユタ州立大学のアルツハイマー病および認知症研究センターからのシード助成金(Vargis)によって提供されました。
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
Referências
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