In vitro 모델링을 위한 Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells의 분리
Summary
이 프로토콜은 국소에서 공급된 돼지 눈에서 원발성 망막 색소 상피(RPE) 세포를 얻고 배양하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 세포는 줄기 세포의 고품질 대안 역할을 하며 체외 망막 연구에 적합합니다.
Abstract
망막 색소 상피(RPE)는 광수용체를 지지하는 역할을 하는 외막 외막의 중요한 단층입니다. RPE 변성은 일반적으로 연령 관련 황반 변성(AMD)과 같은 점진적인 시력 상실을 특징으로 하는 질병에서 발생합니다. AMD에 대한 연구는 RPE를 나타내기 위해 인간 기증자의 눈 또는 유도만능줄기세포(iPSC)에 의존하는 경우가 많습니다. 그러나 이러한 RPE 소스는 배양을 위해 연장된 분화 기간과 상당한 전문 지식이 필요합니다. 또한 일부 연구 기관, 특히 농촌 지역의 연구 기관은 기증자의 눈에 쉽게 접근할 수 없습니다. 상업적으로 이용 가능한 불멸의 RPE 세포주(ARPE-19)가 존재하지만, 생체 내 필수 RPE 기능이 부족하고 많은 안과 연구 간행물에서 널리 받아들여지지 않습니다. 보다 쉽게 구할 수 있고 비용 효율적인 소스에서 대표적인 1차 RPE 세포를 확보해야 할 필요성이 시급합니다. 이 프로토콜은 돼지 눈에서 사후 검시한 1차 RPE 세포의 분리 및 하위 배양을 설명하며, 이는 상업 또는 학술 공급업체로부터 현지에서 공급받을 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조직 배양 실험실에서 일반적으로 볼 수 있는 일반적인 재료가 필요합니다. 그 결과 iPSC, 인간 기증자 눈 및 ARPE-19 세포에 대한 1차적이고 차별화된 비용 효율적인 대안이 탄생했습니다.
Introduction
망막 색소 상피(RPE)는 브루흐 막과 광수용체 사이의 외막 망막에 위치한 단층이다1. RPE 세포는 zonula occludens-1 (ZO-1)과 같은 단백질과 긴밀한 연접을 형성하고 색소 침착 및 육각형 형태 2,3을 특징으로하는 독특한 표현형을 가지고 있습니다. 이 세포는 혈액-망막 장벽에 기여하여 광수용체 건강을 지원하고 망막 항상성을 유지합니다 4,5. 또한 RPE 세포는 빛을 흡수하고 광수용체의 필수 구성 요소를 재활용함으로써 시력에 중요한 역할을 합니다6. 예를 들어, RPE 세포에서 고도로 발현되는 단백질인 RPE65는 all-trans 레티닐 에스테르를 11-시스 레티놀 7,8로 전환합니다. RPE 세포가 수행하는 다양한 기능을 감안할 때, RPE 세포의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성 및 당뇨병성 망막병증을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다 9,10. 망막 병리학에 대한 이해를 높이고 새로운 치료법을 개발하기 위해 망막의 체외 모델이 자주 사용됩니다.
건강한 망막 또는 병든 망막의 대표 모델을 생성하려면 모방 RPE 세포 유형을 사용하는 것이 필수적입니다. 상업적으로 이용 가능한 ARPE-19 세포주는 색소 침착과 같은 네이티브 표현형이 없는 반면, iPSC는 11,12,13을 분화하는 데 수개월이 걸릴 수 있습니다. 인간 기증자의 눈이 이상적일 수 있지만 많은 연구실에서 쉽게 사용할 수 없는 경우가 많습니다.
여기에서, 우리는 1차 RPE 세포를 얻기 위해 인간의 눈(14)과 많은 유사성을 공유하는 돼지 눈을 활용하는 방법을 고안했다. 이들 일차 돼지 RPE 세포는 다수의 망막 모델에서 이용되어 왔다15,16. 이러한 세포는 비용 효율적일 뿐만 아니라 iPSC 또는 기증자의 눈보다 획득하는 데 더 적은 시간이 필요합니다. 또한 색소 침착 및 미세 융모와 같은 고유 특성을 나타냅니다. 돼지 RPE 추출을 위한 유사한 프로토콜이 존재하지만(17,18,19), 이 간단하고 상세한 기술은 효소 해리를 추가로 검증하고 대부분의 세포 배양 실험실에서 흔히 볼 수 있는 물질을 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 돼지 눈에서 RPE 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 색소 침착 및 조약돌 형태는 분리 후 7일 이내에 관찰됩니다(그림 1B). 더욱이, TEER 데이터는 단단한 접합 형성(22 )과 건강한 단층을 나타낸다(그림 5). 이러한 결과는 이 방법으로 분리한 RPE 세포가 인간 RPE와 유사하며 망막 세포 배양 모델에 도움이 될 수 있음을 보여?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 돼지 RPE 세포 배양 및 분리에 도움을 준 Farhad Farjood와 SEM에 도움을 준 Thomas Harris에게 감사의 뜻을 전합니다. 저자들은 SEM 분석을 위해 유타 주립 대학의 현미경 핵심 시설(Microscopy Core Facility)의 지원을 인정합니다. 이 시설은 미국 국립과학재단(National Science Foundation) 주요 연구 기기 보조금(CMMI-1337932)을 통해 획득한 주사 전자 현미경을 보유하고 있습니다. 이 연구에 대한 자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 보조금 1R15EY028732(Vargis)와 BrightFocus Foundation 보조금 M2019109(Vargis)을 통해 제공되었습니다. 추가 기금은 유타 주립 대학교 연구실의 학부 연구 및 창의적 기회 보조금(Weatherston)과 유타 주립 대학교 알츠하이머병 및 치매 연구 센터의 종자 보조금(Vargis)으로 제공되었다.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
Referências
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