Aislamiento de células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina para modelado in vitro
Summary
Este protocolo describe el procedimiento para obtener y cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (EPR) a partir de ojos porcinos de origen local. Estas células sirven como una alternativa de alta calidad a las células madre y son adecuadas para la investigación in vitro de la retina.
Abstract
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa crucial en la retina externa responsable de soportar los fotorreceptores. La degeneración del EPR ocurre comúnmente en enfermedades marcadas por la pérdida progresiva de la visión, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). La investigación sobre la DMAE a menudo se basa en ojos de donantes humanos o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para representar el EPR. Sin embargo, estas fuentes de EPR requieren períodos de diferenciación prolongados y una experiencia sustancial para el cultivo. Además, algunas instituciones de investigación, en particular las de las zonas rurales, carecen de fácil acceso a los ojos de los donantes. Si bien existe una línea celular de EPR inmortalizada disponible comercialmente (ARPE-19), carece de características esenciales de EPR in vivo y no es ampliamente aceptada en muchas publicaciones de investigación oftalmológica. Existe una necesidad apremiante de obtener células primarias representativas del EPR de una fuente más fácilmente disponible y rentable. Este protocolo dilucida el aislamiento y subcultivo de células primarias de EPR obtenidas post-mortem de ojos porcinos, que pueden obtenerse localmente de proveedores comerciales o académicos. Este protocolo requiere materiales comunes que normalmente se encuentran en los laboratorios de cultivo de tejidos. El resultado es una alternativa primaria, diferenciada y rentable a las iPSC, los ojos de donantes humanos y las células ARPE-19.
Introduction
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa situada en la retina externa entre la membrana de Bruch y los fotorreceptores1. Las células del EPR forman uniones estrechas con proteínas como la zonula occludens-1 (ZO-1) y poseen un fenotipo distintivo caracterizado por pigmentación y morfología hexagonal 2,3. Estas células contribuyen a la barrera hematorretiniana, apoyando así la salud de los fotorreceptores y manteniendo la homeostasis de la retina 4,5. Además, las células del EPR desempeñan un papel fundamental en la visión al absorber la luz y reciclar componentes esenciales para los fotorreceptores6. Por ejemplo, RPE65, una proteína altamente expresada en las células EPR, convierte los ésteres de retinol trans en retinol 11-cis 7,8. Dada la multitud de funciones que realizan las células EPR, su disfunción está implicada en diversas enfermedades, como la degeneración macular asociada a la edad y la retinopatía diabética 9,10. Para mejorar la comprensión de las patologías de la retina y desarrollar nuevos tratamientos, se emplean con frecuencia modelos in vitro de la retina.
Para generar modelos representativos de retinas sanas o enfermas, es imprescindible utilizar un tipo de célula mimética del EPR. La línea celular ARPE-19 disponible comercialmente carece de fenotipos nativos, como la pigmentación, mientras que las iPSC pueden tardar meses en diferenciarse 11,12,13. Aunque los ojos de donantes humanos pueden ser ideales, a menudo no están disponibles para muchos laboratorios de investigación.
Aquí, hemos ideado un método para utilizar ojos porcinos, que comparten muchas similitudes con los ojos humanos14, para obtener células primarias del EPR. Estas células primarias del EPR porcino se han utilizado en múltiples modelos de retina15,16. Estas células no solo son rentables, sino que también requieren menos tiempo para adquirirse que las iPSC o los ojos de donante. Además, exhiben características nativas, como pigmentación y microvellosidades. Si bien existen protocolos similares para la extracción de EPR porcino 17,18,19, esta técnica sencilla y detallada valida aún más la disociación enzimática y emplea materiales que se encuentran comúnmente en la mayoría de los laboratorios de cultivos celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe cómo aislar las células del EPR de los ojos porcinos. La pigmentación y la morfología de los adoquines se observan a los 7 días del aislamiento (Figura 1B). Además, los datos de TEER indican la formación de uniones estrechas22 y una monocapa saludable (Figura 5). Estos resultados muestran que las células de EPR aisladas con este método son similares a las EPR humanas y pueden ser beneficiosas en modelos de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Farhad Farjood por su ayuda con el cultivo y aislamiento de células de EPR porcino y a Thomas Harris por su ayuda con SEM. Los autores agradecen el apoyo de la Instalación Central de Microscopía de la Universidad Estatal de Utah para el análisis SEM. La instalación mantiene un microscopio electrónico de barrido adquirido a través de una subvención de instrumentación de investigación principal de la Fundación Nacional de Ciencias (CMMI-1337932). La financiación de este estudio fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud a través de la subvención 1R15EY028732 (Vargis) y una subvención de la Fundación BrightFocus M2019109 (Vargis). Se proporcionaron fondos adicionales mediante una beca de investigación de pregrado y oportunidades creativas (Weatherston) de la Oficina de Investigación de la Universidad Estatal de Utah y una subvención inicial (Vargis) del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer y la Demencia de la Universidad Estatal de Utah.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
Referências
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