Isolering av primære retinale pigmentepitelceller fra svin for in vitro-modellering
Summary
Denne protokollen skisserer prosedyren for å skaffe og dyrke primære retinale pigmentepitelceller (RPE) fra lokalt hentede svineøyne. Disse cellene fungerer som et høyverdig alternativ til stamceller og er egnet for in vitro retinal forskning.
Abstract
Retinalpigmentepitelet (RPE) er et avgjørende monolag i den ytre netthinnen som er ansvarlig for å støtte fotoreceptorer. RPE-degenerasjon forekommer ofte i sykdommer som er preget av progressivt synstap, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Forskning på AMD er ofte avhengig av menneskelige donorøyne eller induserte pluripotente stamceller (iPSCs) for å representere RPE. Disse RPE-kildene krever imidlertid utvidede differensieringsperioder og betydelig kompetanse for dyrking. I tillegg mangler noen forskningsinstitusjoner, spesielt de i landlige områder, lett tilgang til donorøyne. Mens en kommersielt tilgjengelig udødeliggjort RPE-cellelinje (ARPE-19) eksisterer, mangler den essensielle in vivo RPE-funksjoner og er ikke allment akseptert i mange oftalmologiforskningspublikasjoner. Det er et presserende behov for å skaffe representative primære RPE-celler fra en lettere tilgjengelig og kostnadseffektiv kilde. Denne protokollen belyser isolering og subkultur av primære RPE-celler oppnådd post mortem fra svineøyne, som kan hentes lokalt fra kommersielle eller akademiske leverandører. Denne protokollen nødvendiggjør vanlige materialer som vanligvis finnes i vevskulturlaboratorier. Resultatet er et primært, differensiert og kostnadseffektivt alternativ til iPSCs, menneskelige donorøyne og ARPE-19-celler.
Introduction
Retinalpigmentepitelet (RPE) er et monolag som ligger i den ytre netthinnen mellom Bruchs membran og fotoreseptorene1. RPE-celler danner tette kryss med proteiner som zonula occludens-1 (ZO-1) og har en særegen fenotype karakterisert ved pigmentering og sekskantet morfologi 2,3. Disse cellene bidrar til blod-retinalbarrieren, og støtter dermed fotoreceptorhelsen og opprettholder retinal homeostase 4,5. I tillegg spiller RPE-celler en kritisk rolle i synet ved å absorbere lys og resirkulere viktige komponenter for fotoreceptorene6. For eksempel konverterer RPE65, et protein høyt uttrykt i RPE-celler, all-trans retinylestere til 11-cis retinol 7,8. Gitt de mange funksjonene som utføres av RPE-celler, er deres dysfunksjon involvert i ulike sykdommer, inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon og diabetisk retinopati 9,10. For å øke forståelsen av retinale patologier og utvikle nye behandlinger, brukes in vitro-modeller av netthinnen ofte.
For å generere representative modeller av sunne eller syke retinaer, er det viktig å bruke en mimetisk RPE-celletype. Den kommersielt tilgjengelige ARPE-19-cellelinjen mangler innfødte fenotyper, for eksempel pigmentering, mens iPSCs kan ta måneder å skille 11,12,13. Selv om menneskelige donorøyne kan være ideelle, er de ofte ikke lett tilgjengelige for mange forskningslaboratorier.
Her har vi utviklet en metode for å utnytte svineøyne, som deler mange likheter med menneskelige øyne14, for å oppnå primære RPE-celler. Disse primære svine-RPE-cellene har blitt brukt i flere retinale modeller15,16. Ikke bare er disse cellene kostnadseffektive, men de krever også mindre tid å skaffe seg enn iPSCs eller donorøyne. I tillegg viser de innfødte egenskaper, som pigmentering og mikrovilli. Mens lignende protokoller for RPE-ekstraksjon av svin eksisterer 17,18,19, validerer denne enkle og detaljerte teknikken ytterligere enzymatisk dissosiasjon og bruker materialer som ofte finnes i de fleste cellekulturlaboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan man isolerer RPE-celler fra svineøyne. Pigmentering og brosteinsmorfologi ses innen 7 dager etter isolasjon (figur 1B). Videre indikerer TEER-data tett kryssdannelse22 og et sunt monolag (figur 5). Disse resultatene viser at RPE-celler isolert med denne metoden ligner på human RPE og kan være fordelaktige i retinale cellekulturmodeller.
Øynene som brukes i dette manuskrip…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Farhad Farjood for hjelp med svin RPE cellekultur og isolasjon og Thomas Harris for hjelp med SEM. Forfatterne anerkjenner støtten fra Microscopy Core Facility ved Utah State University for SEM-analysen. Anlegget opprettholder et skanningelektronmikroskop anskaffet gjennom et National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Finansiering for denne studien ble gitt av en National Institutes of Health gjennom Grant 1R15EY028732 (Vargis) og en BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Ytterligere finansiering ble gitt av et Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) fra Utah State University’s Office of Research og et frøstipend (Vargis) fra Utah State Universitys Alzheimers sykdom og demensforskningssenter.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
Referências
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
