В этом протоколе описывается процедура получения и культивирования первичных клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз свиней местного происхождения. Эти клетки служат высококачественной альтернативой стволовым клеткам и подходят для исследований сетчатки in vitro .
Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) является важным монослоем во внешней части сетчатки, отвечающим за поддержку фоторецепторов. Дегенерация РПЭ обычно возникает при заболеваниях, характеризующихся прогрессирующей потерей зрения, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Исследования ВМД часто опираются на донорские глаза человека или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) для представления РПЭ. Однако эти источники РПЭ требуют длительных периодов дифференциации и значительного опыта для культивирования. Кроме того, некоторые научно-исследовательские институты, особенно в сельской местности, не имеют легкого доступа к донорским глазам. Несмотря на то, что существует коммерчески доступная иммортализированная клеточная линия RPE (ARPE-19), она не обладает существенными характеристиками RPE in vivo и не получила широкого распространения во многих научных публикациях по офтальмологии. Существует насущная потребность в получении репрезентативных первичных клеток РПЭ из более доступного и экономически эффективного источника. Этот протокол разъясняет изоляцию и субкультуру первичных клеток РПЭ, полученных посмертно из свиных глаз, которые могут быть получены на месте у коммерческих или академических поставщиков. Для этого протокола требуются обычные материалы, которые обычно встречаются в лабораториях для культивирования тканей. В результате получается первичная, дифференцированная и экономически эффективная альтернатива ИПСК, донорским глазам человека и клеткам ARPE-19.
Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой монослой, расположенный в наружной части сетчатки между мембраной Бруха и фоторецепторами1. Клетки RPE образуют плотные соединения с белками, такими как zonula occludens-1 (ZO-1), и обладают характерным фенотипом, характеризующимся пигментацией и гексагональной морфологией 2,3. Эти клетки вносят свой вклад в гемато-ретинальный барьер, тем самым поддерживая здоровье фоторецепторов и поддерживая гомеостаз сетчатки 4,5. Кроме того, клетки RPE играют важнейшую роль в зрении, поглощая свет и перерабатывая важныекомпоненты для фоторецепторов. Например, RPE65, белок, высоко экспрессируемый в клетках RPE, превращает полностью транс-ретиниловые эфиры в 11-цис-ретинол 7,8. Учитывая множество функций, выполняемых клетками РПЭ, их дисфункция связана с различными заболеваниями, включая возрастную макулярную дегенерацию и диабетическую ретинопатию 9,10. Для углубления понимания патологий сетчатки и разработки новых методов лечения часто используются модели сетчатки in vitro.
Для создания репрезентативных моделей здоровой или больной сетчатки необходимо использовать миметический тип клеток RPE. Коммерчески доступная клеточная линия ARPE-19 не имеет нативных фенотипов, таких как пигментация, в то время как ИПСК могут дифференцироваться месяцами 11,12,13. Несмотря на то, что донорские глаза человека могут быть идеальными, они часто недоступны для многих исследовательских лабораторий.
Здесь мы разработали метод использования свиных глаз, которые имеют много общего с человеческими глазами14, для получения первичных клеток RPE. Эти первичные клетки RPE свиней были использованы в нескольких моделях сетчатки15,16. Эти клетки не только экономически эффективны, но и требуют меньше времени для получения, чем ИПСК или донорские глаза. Кроме того, они проявляют естественные характеристики, такие как пигментация и микроворсинки. Несмотря на то, что существуют аналогичные протоколы для экстракции РПЭ свиней 17,18,19, этот простой и подробный метод дополнительно подтверждает ферментативную диссоциацию и использует материалы, обычно встречающиеся в большинстве лабораторий клеточных культур.
В этом протоколе описывается, как изолировать клетки RPE от глаз свиньи. Пигментация и морфология булыжника наблюдаются в течение 7 дней после изоляции (рис. 1B). Кроме того, данные TEER указывают на плотное соединение22 и здоровый монослой (рис. 5). ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Фархада Фарджуда за помощь в культивировании и выделении клеток RPE свиней и Томаса Харриса за помощь в SEM. Авторы выражают признательность Центру микроскопии Университета штата Юта за поддержку СЭМ-анализа. На объекте установлен сканирующий электронный микроскоп, приобретенный в рамках гранта Национального научного фонда (CMMI-1337932). Финансирование этого исследования было предоставлено Национальными институтами здравоохранения в рамках гранта 1R15EY028732 (Vargis) и гранта BrightFocus Foundation M2019109 (Vargis). Дополнительное финансирование было предоставлено грантом на исследования и творческие возможности для студентов (Weatherston) от Управления исследований Университета штата Юта и начальным грантом (Vargis) от Исследовательского центра болезни Альцгеймера и деменции Университета штата Юта.
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
Biosafety Cabinet | |||
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
Centrifuge | |||
Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
Deionized Water | |||
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
Flashlight | |||
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
Ice | Crushed prefered | ||
Inverted Phase Contrast Microscope | |||
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
Vacuum Aspiration System | |||
Water Bath, 37 °C | |||
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |