Microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon
Summary
Nous présentons un protocole détaillé pour la microscopie corrélative à la lumière et à la lumière électronique post-intégration d’Epon en utilisant une protéine fluorescente appelée mScarlet. Cette méthode permet de maintenir simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Cette technique se prête à une grande variété d’applications biologiques.
Abstract
La microscopie corrélative à la lumière et aux électrons (CLEM) est une microscopie complète qui combine les informations de localisation fournies par la microscopie à fluorescence (FM) et le contexte de l’ultrastructure cellulaire acquise par microscopie électronique (EM). CLEM est un compromis entre la fluorescence et l’ultrastructure, et généralement, l’ultrastructure compromet la fluorescence. Comparé à d’autres résines d’enrobage hydrophiles, telles que le méthacrylate de glycidyle, HM20 ou K4M, Epon est supérieur en termes de propriétés de préservation des ultrastructures et de sectionnement. Auparavant, nous avions démontré que mEosEM peut survivre à la fixation au tétroxyde d’osmium et à l’intégration d’Epon. En utilisant mEosEM, nous avons obtenu, pour la première fois, Epon post embedded CLEM, qui maintient simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Ici, nous fournissons des détails étape par étape sur la préparation de l’échantillon EM, l’imagerie FM, l’imagerie EM et l’alignement de l’image. Nous améliorons également les procédures d’identification de la même cellule imagée par imagerie FM pendant l’imagerie EM et détaillons l’alignement entre les images FM et EM. Nous pensons que l’on peut facilement réaliser la microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon en suivant ce nouveau protocole dans les installations EM traditionnelles.
Introduction
La microscopie à fluorescence (FM) peut être utilisée pour obtenir la localisation et la distribution de la protéine cible. Cependant, le contexte qui entoure la protéine cible est perdu, ce qui est crucial pour étudier la protéine cible de manière approfondie. La microscopie électronique (EM) a la résolution d’imagerie la plus élevée, fournissant plusieurs détails subcellulaires. Néanmoins, EM manque d’étiquetage cible. En fusionnant avec précision l’image de fluorescence prise par FM avec l’image grise acquise par EM, la microscopie corrélative et électronique (CLEM) peut combiner les informations obtenues par ces deux modes d’imagerie 1,2,3,4.
CLEM est un compromis entre la fluorescence et l’ultrastructure1. En raison des limites des protéines fluorescentes actuelles et des procédures traditionnelles de préparation des échantillons EM, en particulier l’utilisation d’acide osmique (OsO4) et de résines hydrophobes telles que l’Epon, l’ultrastructure compromet toujours la fluorescence5. OsO4 est un réactif indispensable dans la préparation des échantillons EM, qui est utilisé pour améliorer le contraste des images EM. Comparé à d’autres résines d’enrobage, Epon est supérieur en termes de propriétés de conservation et de coupe des ultrastructures5. Cependant, aucune protéine fluorescente ne peut retenir le signal de fluorescence après le traitement d’OsO4 et d’Epon embedding6. Pour surmonter les limites des protéines fluorescentes, le CLEM de pré-intégration a été développé, dans lequel l’imagerie FM est effectuée avant la préparation de l’échantillon EM6. Cependant, l’inconvénient du CLEM pré-intégré est le recalage imprécis entre les images FM et EM5.
Au contraire, la méthode CLEM post-intégration effectue l’imagerie FM après la préparation de l’échantillon EM, dont la précision de repérage peut atteindre 6-7 nm 5,6. Pour conserver la fluorescence des protéines fluorescentes, de très faibles concentrations d’OsO4 (0,001 %)3 ou les méthodes de préparation EM congelées à haute pression (HPF) et de substitution par congélation (FS) 4,7 ont été utilisées au détriment de l’ultrastructure compromise ou du contraste de l’image EM. Le développement de mEos4b favorise grandement les progrès de CLEM post-intégration, bien que le méthacrylate de glycidyle soit utilisé comme résine d’enrobage5. Avec le développement de mEosEM, qui peut survivre à la coloration OsO4 et à l’enrobage d’Epon, le CLEM de super-encastrement post-enrobage d’Epon a été réalisé pour la première fois, en maintenant la fluorescence et l’ultrastructure simultanément6. Après mEosEM, plusieurs protéines fluorescentes capables de survivre à la coloration OsO4 et à l’enrobage d’Epon ont été développées 8,9,10,11. Cela favorise grandement le développement de CLEM.
Il y a trois aspects clés à Epon post-intégration CLEM. La première est la protéine fluorescente, qui doit maintenir le signal fluorescent après la préparation de l’échantillon EM. D’après notre expérience, mScarlet est supérieur aux autres protéines fluorescentes signalées. La seconde est de savoir comment trouver la même cellule imagée par imagerie FM en imagerie EM. Pour résoudre ce problème, nous améliorons la procédure de cette étape afin que l’on puisse facilement trouver la cellule ciblée. La dernière est la méthode pour aligner l’image FM avec l’image EM. Ici, nous détaillons le recalage entre les images FM et EM. Dans ce protocole, nous exprimons mScarlet dans les neurones VGLUT2 et démontrons que mScarlet peut cibler les lysosomes secondaires en utilisant le CLEM post-intégration d’Epon. Nous fournissons des détails étape par étape pour le CLEM post-enrobage Epon, sans compromettre la fluorescence et l’ultrastructure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici est une méthode d’imagerie polyvalente, qui peut combiner les informations de localisation de la protéine cible par microscopie optique (LM) et le contexte entourant la protéine cible par microscopie électronique (EM)6. Avec les limites des protéines fluorescentes actuelles, la méthode largement utilisée est la microscopie corrélative à la lumière et à l’électronium (CLEM), ce qui signifie que l’imagerie LM est effectuée avant la préparation de l’?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32201235 à Zhifei Fu), la Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (2022J01287 à Zhifei Fu), la Fondation de recherche pour les talents avancés de l’Université médicale du Fujian, Chine (XRCZX2021013 à Zhifei Fu), la Fondation des sciences spéciales des finances de la province du Fujian, Chine (22SCZZX002 à Zhifei Fu), Fondation du laboratoire clé du NHC pour l’évaluation technique de la régulation de la fertilité chez les primates non humains et de l’hôpital de santé maternelle et infantile du Fujian (2022-NHP-04 à Zhifei Fu). Nous remercions Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin et Yan Hu du Centre de services technologiques publics de l’Université médicale du Fujian pour leur soutien dans la préparation des échantillons EM et l’imagerie EM.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
Referências
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