Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu
Summary
mScarlet adı verilen bir floresan proteini kullanarak Epon gömme sonrası bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyabilir. Bu teknik, çok çeşitli biyolojik uygulamalara uygundur.
Abstract
Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), floresan mikroskobu (FM) tarafından sağlanan lokalizasyon bilgilerini ve elektron mikroskobu (EM) tarafından elde edilen hücresel üst yapı bağlamını birleştiren kapsamlı bir mikroskopidir. CLEM, floresan ve üst yapı arasında bir değiş tokuştur ve genellikle üst yapı floresansı tehlikeye atar. Glisidil metakrilat, HM20 veya K4M gibi diğer hidrofilik gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon, üst yapı koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür. Daha önce, mEosEM’nin osmiyum tetroksit fiksasyonuna ve Epon gömülmesine dayanabileceğini göstermiştik. mEosEM’i kullanarak, ilk kez, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyan Epon post gömme CLEM’i elde ettik. Burada, EM numune hazırlama, FM görüntüleme, EM görüntüleme ve görüntü hizalama hakkında adım adım ayrıntılar sunuyoruz. Ayrıca, EM görüntüleme sırasında FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücreyi tanımlama prosedürlerini iyileştiriyoruz ve FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Geleneksel EM tesislerinde bu yeni protokolü takiben Epon post gömülü bağıntılı ışık ve elektron mikroskobunun kolayca elde edilebileceğine inanıyoruz.
Introduction
Floresan mikroskobu (FM), hedef proteinin lokalizasyonunu ve dağılımını elde etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, hedef proteini çevreleyen bağlam kaybolur, bu da hedef proteini iyice araştırmak için çok önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), birkaç hücre altı ayrıntı sağlayan en yüksek görüntüleme çözünürlüğüne sahiptir. Bununla birlikte, EM hedef etiketlemeden yoksundur. FM tarafından alınan floresan görüntüsünü EM tarafından elde edilen gri görüntü ile doğru bir şekilde birleştirerek, bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), bu iki görüntüleme modu 1,2,3,4 tarafından elde edilen bilgileri birleştirebilir.
CLEM, floresan ve üst yapı1 arasında bir değiş tokuştur. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ve geleneksel EM numune hazırlama prosedürleri, özellikle osmik asit (OsO4) ve Epon gibi hidrofobik reçinelerin kullanımı nedeniyle, üst yapı her zaman floresan5’i tehlikeye atar. OsO4 , EM görüntülerinin kontrastını iyileştirmek için kullanılan EM numune hazırlamada vazgeçilmez bir reaktiftir. Diğer gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon ultrastrüktür koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür5. Bununla birlikte, hiçbir floresan proteini,OSo4 ve Epon gömme6’nın tedavisinden sonra floresan sinyalini tutamaz. Floresan proteinlerin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, EM numune hazırlamadan önce FM görüntülemenin yapıldığı önceden gömülü CLEM geliştirilmiştir6. Bununla birlikte, CLEM’i önceden gömmenin dezavantajı, FM ve EM görüntüleri arasındaki kesin olmayan kayıttır5.
Aksine, gömme sonrası CLEM yöntemi, kayıt doğruluğu 6-7 nm 5,6’ya ulaşabilen EM numune hazırlığından sonra FM görüntülemeyi gerçekleştirir. Floresan proteinlerin floresansını korumak için, çok düşük konsantrasyonlarda OsO4 (% 0.001)3 veya yüksek basınçlı dondurulmuş (HPF) ve dondurarak ikame (FS) EM hazırlama yöntemleri 4,7, bozulmuş üst yapı veya EM görüntüsünün kontrastı pahasına kullanılmıştır. Gömme reçinesi5 olarak glisidil metakrilat kullanılmasına rağmen, mEos4b’nin geliştirilmesi, gömme sonrası CLEM’in ilerlemesini büyük ölçüde destekler. OsO4 boyama ve Epon gömme hayatta kalabilen mEosEM’in geliştirilmesiyle, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyarak ilk kez Epon gömme sonrası süper çözünürlüklü CLEM elde edildi6. mEosEM’den sonra,OsO4 boyamaya ve Epon gömmeye dayanabilen birkaç floresan proteini geliştirildi 8,9,10,11. Bu, CLEM’in gelişimini büyük ölçüde teşvik eder.
Epon gömme sonrası CLEM’in üç temel yönü vardır. Birincisi, EM numune hazırlığından sonra floresan sinyalini koruması gereken floresan proteindir. Deneyimlerimize göre, mScarlet bildirilen diğer floresan proteinlerden üstündür. İkincisi, EM görüntülemede FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücrenin nasıl bulunacağıdır. Bu sorunu çözmek için, hedeflenen hücreyi kolayca bulabilmeniz için bu adımın prosedürünü iyileştiriyoruz. Sonuncusu, FM görüntüsünü EM görüntüsüyle hizalama yöntemidir. Burada, FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Bu protokolde, VGLUT2 nöronlarında mScarlet’i eksprese ediyoruz ve mScarlet’in Epon post-embedding CLEM kullanarak ikincil lizozomları hedefleyebileceğini gösteriyoruz. Floresan ve üst yapıdan ödün vermeden Epon gömme sonrası CLEM için adım adım ayrıntılar sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol, ışık mikroskobundan (LM) hedef proteinin lokalizasyon bilgisini ve elektron mikroskobundan (EM) hedef proteini çevreleyen bağlamı birleştirebilen çok yönlü bir görüntüleme yöntemidir6. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ile yaygın olarak kullanılan yöntem, korelasyon ışığı ve elektron mikroskobunun (CLEM) önceden gömülmesidir, bu da LM görüntülemenin EM numune hazırlığından önce yapıldığı anlamına gelir. Hemen hemen tüm mev…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Zhifei Fu’ya 32201235), Çin’in Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2022J01287’den Zhifei Fu’ya), Fujian Tıp Üniversitesi’ndeki İleri Yetenekler Araştırma Vakfı, Çin (XRCZX2021013’den Zhifei Fu’ya), Çin’in Fujian Eyaleti Finans Özel Bilim Vakfı (22SCZZX002’den Zhifei Fu’ya), NHC İnsan Olmayan Primat için Doğurganlık Düzenlemesinin Teknik Değerlendirmesi Anahtar Laboratuvarı ve Fujian Doğum ve Çocuk Sağlığı Hastanesi’nin kurulması (2022-NHP-04’ten Zhifei Fu’ya). Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknoloji Hizmet Merkezi’nden Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin ve Yan Hu’ya EM numune hazırlama ve EM görüntüleme konusundaki destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
Referências
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
