Epon Post Embedding Microscopia Ottica ed Elettronica Correlativa
Summary
Presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding di Epon utilizzando una proteina fluorescente chiamata mScarlet. Questo metodo può mantenere contemporaneamente la fluorescenza e l’ultrastruttura. Questa tecnica è suscettibile di un’ampia varietà di applicazioni biologiche.
Abstract
La microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM) è una microscopia completa che combina le informazioni di localizzazione fornite dalla microscopia a fluorescenza (FM) e il contesto dell’ultrastruttura cellulare acquisita dalla microscopia elettronica (EM). CLEM è un compromesso tra fluorescenza e ultrastruttura e, di solito, l’ultrastruttura compromette la fluorescenza. Rispetto ad altre resine di inclusione idrofile, come il glicidil metacrilato, HM20 o K4M, Epon è superiore nella conservazione dell’ultrastruttura e nelle proprietà di sezionamento. In precedenza, avevamo dimostrato che mEosEM può sopravvivere alla fissazione del tetrossido di osmio e all’inclusione di epon. Utilizzando mEosEM, abbiamo ottenuto, per la prima volta, Epon post embedding CLEM, che mantiene la fluorescenza e l’ultrastruttura contemporaneamente. Qui, forniamo dettagli dettagliati sulla preparazione del campione EM, l’imaging FM, l’imaging EM e l’allineamento dell’immagine. Miglioriamo anche le procedure per identificare la stessa cellula immaginata dall’imaging FM durante l’imaging EM e dettagliamo la registrazione tra le immagini FM e EM. Riteniamo che si possa facilmente ottenere la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding Epon seguendo questo nuovo protocollo nelle strutture EM tradizionali.
Introduction
La microscopia a fluorescenza (FM) può essere utilizzata per ottenere la localizzazione e la distribuzione della proteina bersaglio. Tuttavia, il contesto che circonda la proteina bersaglio viene perso, il che è fondamentale per studiare a fondo la proteina bersaglio. La microscopia elettronica (EM) ha la più alta risoluzione di imaging, fornendo diversi dettagli subcellulari. Ciononostante, i mercati emergenti non dispongono di un’etichettatura target. Unendo accuratamente l’immagine di fluorescenza acquisita da FM con l’immagine grigia acquisita da EM, la microscopia elettronica e di luce correlativa (CLEM) può combinare le informazioni ottenute da queste due modalità di imaging 1,2,3,4.
CLEM è un compromesso tra la fluorescenza e l’ultrastruttura1. A causa dei limiti delle attuali proteine fluorescenti e delle tradizionali procedure di preparazione dei campioni EM, in particolare l’uso di acido osmico (OsO4) e resine idrofobiche come Epon, l’ultrastruttura compromette sempre la fluorescenza5. OsO4 è un reagente indispensabile nella preparazione dei campioni EM, che viene utilizzato per migliorare il contrasto delle immagini EM. Rispetto ad altre resine per inclusione, Epon è superiore nella conservazione dell’ultrastruttura e nelle proprietà di sezionamento5. Tuttavia, nessuna proteina fluorescente può mantenere il segnale di fluorescenza dopo il trattamento di OsO4 e Eponembedding 6. Per superare i limiti delle proteine fluorescenti, è stato sviluppato il CLEM pre-embedding, in cui l’imaging FM viene eseguito prima della preparazione del campione EM6. Tuttavia, lo svantaggio del pre-embedding CLEM è la registrazione imprecisa tra le immagini FM e EM5.
Al contrario, il metodo CLEM post embedding esegue l’imaging FM dopo la preparazione del campione EM, la cui precisione di registrazione può raggiungere 6-7 nm 5,6. Per mantenere la fluorescenza delle proteine fluorescenti, sono state utilizzate concentrazioni molto basse di OsO4 (0,001%)3 o i metodi di preparazione EM 4,7 congelati ad alta pressione (HPF) e sostitutivi del congelamento (FS)a scapito dell’ultrastruttura compromessa o del contrasto dell’immagine EM. Lo sviluppo di mEos4b promuove notevolmente il progresso del CLEM post-embedding, sebbene il glicidil metacrilato sia utilizzato come resina di inclusione5. Con lo sviluppo di mEosEM, che può sopravvivere alla colorazione di OsO4 e all’inclusione di Epon, è stato raggiunto per la prima volta il CLEM a super-risoluzione post-inclusione di Epon, mantenendo la fluorescenza e l’ultrastruttura contemporaneamente6. Dopo mEosEM, sono state sviluppate diverse proteine fluorescenti in grado di sopravvivere alla colorazione di OsO4 e all’inclusione di Epon 8,9,10,11. Questo favorisce notevolmente lo sviluppo di CLEM.
Ci sono tre aspetti chiave per Epon post-embedding CLEM. La prima è la proteina fluorescente, che dovrebbe mantenere il segnale fluorescente dopo la preparazione del campione EM. Secondo la nostra esperienza, mScarlet è superiore ad altre proteine fluorescenti riportate. Il secondo è come trovare la stessa cellula visualizzata dall’imaging FM nell’imaging EM. Per risolvere questo problema, miglioriamo la procedura per questo passaggio in modo che si possa trovare facilmente la cellula bersaglio. L’ultimo è il metodo per allineare l’immagine FM con l’immagine EM. Qui, descriviamo in dettaglio la registrazione tra le immagini FM e EM. In questo protocollo, esprimiamo mScarlet nei neuroni VGLUT2 e dimostriamo che mScarlet può colpire i lisosomi secondari utilizzando Epon post-embedding CLEM. Forniamo dettagli passo-passo per il CLEM post-inclusione di Epon, senza compromettere la fluorescenza e l’ultrastruttura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato è un metodo di imaging versatile, in grado di combinare le informazioni di localizzazione della proteina bersaglio dalla microscopia ottica (LM) e il contesto che circonda la proteina bersaglio dalla microscopia elettronica (EM)6. Con i limiti delle attuali proteine fluorescenti, il metodo ampiamente utilizzato è il pre-embedding della microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM), il che significa che l’imaging LM viene eseguito prima della preparazione del c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32201235 a Zhifei Fu), dalla Natural Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (2022J01287 a Zhifei Fu), dalla Research Foundation for Advanced Talents presso la Fujian Medical University, Cina (XRCZX2021013 a Zhifei Fu), dalla Finance Special Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (22SCZZX002 a Zhifei Fu), Fondazione del laboratorio chiave NHC di valutazione tecnica della regolazione della fertilità per primati non umani e dell’ospedale per la salute della maternità e del bambino del Fujian (2022-NHP-04 a Zhifei Fu). Ringraziamo Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin e Yan Hu presso il Public Technology Service Center della Fujian Medical University per il supporto nella preparazione dei campioni EM e nell’imaging EM.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
Referências
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