Summary
Her beskriver vi en plattform som tillater ikke-invasiv in vivo-avbildning av leversfæroider innpodet i museøyets fremre kammer. Arbeidsflyten spenner fra å generere sfæroider fra primære leverceller til transplantasjon i museøyet og in vivo-avbildning ved cellulær oppløsning ved konfokalmikroskopi.
Abstract
Biomedisinske studier av leveren hos pattedyr hindres av mangel på metoder for in vivo ikke-invasiv langsgående avbildning ved cellulær oppløsning. Hittil er optisk avbildning av leveren in situ mulig ved intravital bildebehandling, som tilbyr høyoppløselig avbildning på mobilnivå, men kan ikke utføres flere ganger og derfor langsgående i samme dyr. Ikke-invasive bildebehandlingsmetoder, som bioluminescens, tillater gjentatte bildebehandlingsøkter på samme dyr, men oppnår ikke celleoppløsning. For å løse dette metodegapet har vi utviklet en plattform for ikke-invasiv in vivo-avbildning av leversfæroider som er podet i museøyets fremre kammer. I arbeidsflyten beskrevet i denne studien genereres primære museleversfæroider in vitro og transplanteres inn i det fremre kammeret i øyet til mottakermus, hvor de engraft på iris. Hornhinnen fungerer som et naturlig kroppsvindu gjennom hvilket vi kan avbilde de engrafted sfæroider ved konvensjonell konfokal mikroskopi. Sfæroidene overlever i flere måneder i øyet, hvor cellene kan studeres i sammenheng med helse og sykdom, samt overvåkes som respons på forskjellige stimuli over gjentatte bildebehandlingsøkter ved hjelp av passende fluorescerende prober. I denne protokollen gir vi en oversikt over de nødvendige trinnene for å implementere dette bildebehandlingssystemet og forklarer hvordan du best kan utnytte potensialet.
Introduction
Overvåking av leverfunksjon hos pattedyr under helse og sykdom er begrenset av mangel på høyoppløselige, ikke-invasive in vivo bildebehandlingsteknikker. Visualiseringen av dette organet hindres av sin utilgjengelige plassering, og for å sette sammen cellulære prosesser, er in vivo-studier avhengige av ofring av dyr på forskjellige tidspunkter. For å omgå denne bildebegrensningen er mye arbeid avhengig av in vitro-modeller , hvor leverlignende mikrovev visualiseres og studeres i et kontrollert miljø.
I de senere år har utviklingen av tredimensjonale kultursystemer, som leversfæroider, hjulpet og avansert leverforskning. Leversfæroider er multicellulære aggregater som etterligner mikromiljøet og komplekse celle-celle-interaksjoner av levervev til en viss grad1 og gir klare fordeler i forhold til tradisjonelle monolagskulturer 2,3. Lever sfæroider brukes også som modeller for ulike leversykdommer 4,5,6 og har vært medvirkende til å forstå sykdomsmekanismer. Likevel er de viktigste begrensningene ved dagens in vitro levermodeller mangelen på et fysiologisk in vivo-miljø og den begrensede utnyttelsestiden i kultur (rundt 20 dager)3. Leversfæroider har tidligere blitt transplantert til forskjellige steder in vivo, for eksempel under nyrekapsel7 eller intraperitonealt8, som ikke er tilgjengelige for optisk avbildning. Intravital leveravbildning er en toppmoderne teknikk som tilbyr celleoppløsning i sanntid. For tiden er denne in situ leveravbildningen bare mulig på det eksterioriserte organet, som er svært invasivt og ofte terminal9. Selv om montering av et bukvindu vil tillate gjentatte leveravbildningsøkter, innebærer det komplisert kirurgi og etterbehandling.
For å utføre langsgående overvåking ved cellulær oppløsning, utforsket vi transplantasjon av leversfæroider i øyets fremre kammer (ACE) hos mus, hvor det leverlignende vevet er innpodet i et fysiologisk miljø, koblet til kroppsstimuli og tilgjengelig for optisk avbildning. Hornhinnen er et gjennomsiktig vev og fungerer som et vindu gjennom hvilket mikrovev innpodet på iris kan avbildes ikke-invasivt og langsgående ved konfokal mikroskopi. Her presenterer vi en arbeidsflyt av denne nyutviklede plattformen for in vivo avbildning av leversfæroider10. Denne protokollen er en trinnvis veiledning for implementeringen, delt inn i (1) ekstraksjon av primære leverceller fra mus og in vitro-dannelse av leversfæroider, (2) transplantasjon av leversfæroider i ACE hos mottakermus, og (3) in vivo-avbildning av transplanterte leversfæroider i bedøvede mus. Videre vil vi vise frem noen av mulighetene og applikasjonene til denne bildebehandlingsplattformen.
Protocol
Alle prosedyrer utført på dyr ble godkjent av Animal Experiment Ethics Committee ved Karolinska Institutet.
1. Ekstraksjon av primære leverceller fra mus og generering av leversfæroider in vitro
- Forberedelse
- For kanylering, leverreseksjon og isolering av primære leverceller, klargjør følgende sterile materialer eller engangsmaterialer i tillegg til serologiske pipetter og sentrifugerør (figur 1A): peristaltisk pumpe, svingbøttesentrifuge, absorberende pute, disseksjonsmatte, to buede tang, kirurgisk saks, en 27 G sommerfuglnål, en 70 μm cellesil, en celleløfter, en 100 mm petriskål, celle-telling kammer, og 96-Well, U-formet-bunn mikroplater.
- Klargjør oppløsningene som brukes ved leverperfusjon, isolering av primære leverceller og generering av leversfæroider som listet opp i tabell 1.
MERK: Fordøyelsesbufferen og Gradient-løsningen skal tilberedes frisk. - Sett opp perfusjonssystemet som består av en peristaltisk pumpe, som leder løsninger fra vannbadet på 42 °C til leveren (figur 1A). Den høyere temperaturen i vannbadet sikrer at bufferne når leveren ved optimal temperatur på 37 °C. Tilpass dette avhengig av rørlengde og romtemperatur (RT).
- For kanyleringen, pass på en 27 G sommerfuglnål til enden av røret. Oppbevar pletteringsmediet som brukes i de siste isolasjonstrinnene ved 4 °C.
- Prosedyre
- Forvarm følgende oppløsninger i vannbadet på 42 °C i 50 ml sentrifugerør: 40 ml PBS, 20 ml perfusjonsbuffer og 12 ml fordøyelsesbuffer.
- For å rengjøre og varme pumperørene, sirkuler ca. 20 ml av den forvarmede PBS.
- Bytt slangen til perfusjonsbufferen, klargjør slangen og sommerfuglnålen, og sett strømningshastigheten til 4 ml/min. Forsikre deg om at det ikke bobler i slangen under bufferendringer gjennom hele protokollen.
- Euthanize musen ved cervical dislokasjon og bruke nåler for å feste lemmer til dissekere bord.
- Våt magepelsen med 70% etanol og dissekere den for å få tilgang til fordøyelseskanaler.
- Flytt tarmen til høyre for å eksponere portvenen og vena cava inferior (figur 1B).
- Kanylere vena cava omtrent halvveis i lengden med nålen i horisontal stilling, sørg for at den er stabil, og start pumpen.
- Når leveren begynner å blåse opp, eller hvite prikker vises i de nærmere lobene, kutt portalvenen for å la blodet og perfusjonsbufferen renne ut.
- Leveren skal begynne å blanchere umiddelbart. Oppmuntre til rydding med buet tang for å klemme portalvenen med 5 s intervaller.
- Gjenta trinn 1.2.9 til leveren er gul og rensket for blod (ca. 15-20 ml perfusjonsbuffer).
- Stopp den peristaltiske pumpen for å bytte slangen til fordøyelsesbufferen og start pumpen på nytt. Når fordøyelsesbufferen når leveren, reduser strømningshastigheten til 2,5 ml / min.
MERK: Den fenolrøde i fordøyelsesbufferen gjør det mulig å diskriminere ankomsten til leveren og muliggjør justering av pumpeparametere under behandlingen. - For å oppmuntre bufferen til å nå alle leverlapper og sikre riktig fordøyelse, gjenta trinn 1.2.9 flere ganger.
- Stopp strømmen av den peristaltiske pumpen når fordøyelsesbufferen er utarmet eller leveren ser tilstrekkelig fordøyd ut.
MERK: Graden av fordøyelse kan overvåkes visuelt ved å forsiktig klemme leverlappene med tang og sjekke om små merker vises på vevet. Leveren vil også bli spinkel. - For å trekke ut leveren, kutt leverleddbåndene og forbindelsene i bukhulen, med sikte på å fjerne den helt, og legg den i petriskålen som inneholder 10 ml kaldt beleggmedium (tabell 1).
- Etter å ha fjernet galleblæren, gjør små klemmer på lobene ved hjelp av tang, lett rive leverkapselen. Ved å riste leveren i parabolen, observer celler som strømmer ut i mediet.
- Hold leveren jevn med tang, dra forsiktig celleløfteren langs lobene for å frigjøre cellene.
MERK: Korrekt interlobulær fordøyelse vil føre til cellesuspensjon i mediet, ikke vevsfragmenter. - Bruk en serologisk pipette til å samle cellesuspensjonen fra petriskålen og filtrere gjennom 70 μm cellesilen plassert på et 50 ml sentrifugerør. Bruk ferske plating media til å vaske parabolen av fordøyde leveren celler og overføre dem til filteret.
- Sentrifuge ved 50 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere cellene.
- Fjern supernatanten, etterlat ca. 1 ml til å dekke cellepelleten, virvle røret for å resuspendere cellene, og tilsett deretter gradvis 10 ml kaldt beleggmedium.
- Tilsett 10 ml gradientoppløsning til cellesuspensjonen og snu røret forsiktig 10 ganger.
- Sentrifuge ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Pelleten inneholder levedyktige leverceller beriket for hepatocytter, mens supernatanten inneholder døde celler og rusk. Kast supernatanten med en serologisk pipette, etterlater ca. 1 ml, og resuspender pelleten ved forsiktig virvling.
- Tilsett 20 ml kaldt beleggmiddel til cellesuspensjonen og sentrifuge ved 50 x g i 5 minutter ved 4 °C for å vaske av gradientoppløsningen.
- Fjern supernatanten, etterlat ca. 1 ml over pelleten, og resuspender cellene i 20 ml kaldt pletteringsmedium.
MERK: Her kan cellepelleten komprimeres, så bruk om nødvendig en 10 ml serologisk pipette for å forsiktig dissosiere cellene. - Bestem cellenummer og levedyktighet manuelt ved hjelp av et celletellingskammer og Trypan Blue.
MERK: Hepatocyttcellene vil raskt utfelle i røret; For å resuspendere dem, snu forsiktig røret noen ganger. - Frø levercellene i 200 μL / brønn av pletteringsmedium ved 1200 celler / brønn i 96-brønns ultra-lave adherensplater.
MERK: Det optimale volumet av media per brønn er 200 μL; Det er imidlertid mulig å frø celler i 100 μL / brønn. - Spinn platene ved 200 x g i 3 minutter for å samle cellene i midten av brønnene.
- Inkuber (37 ° C, 5% CO2) cellene og la dem danne sfæroider i 5 dager naturlig (figur 1C).
- På dag 5 fjerner du forsiktig halvparten av mediet i brønnen og erstatter det med serumfrie vedlikeholdsmedier (tabell 1). Gjenta dette trinnet hver 48. time til dag 10, når leversfæroidene er klare til å bli transplantert.
MERK: Dannelsen av en kapsellignende struktur i dyrkede leversfæroider viser god aggregering og levedyktighet.
2. Transplantasjon av leversfæroider i øyets fremre kammer (ACE)
- Forberedelse
- For transplantasjon av leversfæroider i ACE, sørg for å ordne følgende ressurser (figur 2A): stereomikroskop, isoflurananestesienhet, induksjonskammer, isofluran, varmepute, skreddersydd metallbunnplate, musehodeholder og gassmaske, tang festet til det faste universalleddet, Hamilton 500 μL gjenget stempelsprøyte, silikon, polyetylen og pumpeslange, skreddersydd stump glasskanyle eller 24 G kateter, etanol 70%, sterilt saltvann, sterile 23 G nåler, øyesalve (flytende parafin og vaselin i forholdet 1:1), engangs 1 ml sprøyte og cellesuspensjonsfat 35 mm.
- Rengjør Hamilton sprøyte, slange og kanyle ved å passere 70% etanol og saltvann.
- Fyll Hamilton-sprøyten, slangen og glasskanylen med saltvann og fest Hamilton-sprøyten til benken i horisontal stilling med tape (figur 2A).
- Bruk en skreddersydd stump glasskanyle.
- Forleng en borosilikatglasskapillær ved hjelp av en totrinns mikropipettetrekker til en indre diameter på >300 μm for å tillate aspirasjon av sfæroidene.
- Skrått og sløv spissen med en mikroelektrodeskråkant og utsett kanylespissen for en flamme i noen sekunder for å myke opp kantene.
MERK: Mikroelektrodefaseren består av en roterende slipestein som betjenes manuelt; Derfor gjelder ikke bestemte innstillinger.
- Alternativt kan du konstruere en kanyle ved hjelp av plastdelen av et 24 G kateter (figur 2B).
- Klargjør anestesiisofluran og varm varmeputen til 37 °C.
- Dekk spissene på tangen festet til den faste universelle leddet med et stykke polyetylenrør for å danne en løkke som bidrar til å stabilisere øyet.
- Overfør leversfæroidene fra 96-brønnsplaten til en 35 mm cellesuspensjonsfat med vedlikeholdsmedier ved hjelp av en pipette og 200 μL-spiss.
- Prosedyre
- Bedøv musen i induksjonskammeret med en dose på 2,5 % isofluran og 280 ml/min luft.
- Når musen er bevisstløs, senk anestesien til 1,8 % isofluran og 280 ml/min luft, koble anestesirøret til hodeholderen, og overfør dyret raskt til varmeputen og plasser nesen inne i hodeholderen.
- Immobiliser hodet med skruene, sett øyet forsiktig ut av stikkontakten og fest det med tangen og legg en dråpe saltvann på begge øynene for å forhindre tørking.
- Under stereoskopet, bruk Hamilton-sprøyten til å aspirere og samle leversfæroidene inn i spissen av kanylen og la dem hvile horisontalt på en ren overflate.
MERK: Aspirerende medier sammen med leversfæroidene bidrar til å forhindre at de fester seg til kanyleveggene. - Punkter hornhinnen forsiktig med en 23 G nål og tørk det sivende vandige humøret med et vev. Hvis nødvendig, for å gjøre snittet bredere, skyv forsiktig nålen sidelengs for å skjære hornhinnen.
MERK: En steril engangsnål brukes til å utføre hornhindepunkteringen, slik at hornhinnen ikke desinfiseres før snittet. - Tilsett saltvannsdråper i øyet for å unngå tørking.
- Ta kanylen som inneholder leveren sfæroider og hold den vertikalt slik at sfæroider å gravitere mot spissen av kanylen.
- Sett kanylen forsiktig inn i hullet, og med skråkanten rettet mot pupillen, bruk Hamilton-sprøyten til å sakte drive leversfæroidene inn i ACE (figur 2C).
MERK: Før du fjerner kanylen, anbefales det å vente noen sekunder på at væsketrykket i og utenfor øyet skal justeres og unngå at sfæroidene slipper ut av øyet igjen. - Fra utsiden av hornhinnen, plasser leveren sfæroider rundt eleven og bort fra snittet ved forsiktig prodding hornhinnen med spissen av kanylen (figur 2C).
- Vent ~ 5-10 min for leveren sfæroider å bosette seg på iris før du slipper øyet fra tangen.
- Påfør vaselin øyesalve til det opererte øyet, som bidrar til å smøre og helbrede hornhinnen.
- Hvis ønskelig, fortsett å operere på det andre øyet etter samme metode.
- Før musen vekkes, gis et smertestillende middel for å unngå postoperativt ubehag, for eksempel 0,1 mg/kg buprenorfin i sterilt saltvann, administrert subkutant.
MERK: Bare en dose smertestillende midler ble administrert til musene da de kom seg raskt fra denne lille prosedyren og ikke viste tegn på smerte eller endret oppførsel. Siden denne prosedyren er veldig rask (tar under 10 min) og forårsaker bare mindre ubehag, krever musene ingen postoperativ behandling, annet enn postoperativ analgesi administrert før oppvåkning av dyret.
3. In vivo avbildning av transplanterte leversfæroider i ACE
- Forberedelse
- Klargjør følgende materialer og instrumenter for ikke-invasiv in vivo-avbildning av leversfæroider innpodet i ACE (figur 3A): oppreist konfokalmikroskop, vanndyppemål med lang arbeidsavstand, isoflurananestesienhet, induksjonskammer, isofluran, varmepute, skreddersydd metallbunnplate, musehodeholder og gassmaske, tang festet til det faste universalleddet, kunstig tåregel, øyesalve (flytende parafin og vaselin i forholdet 1:1).
- Valgfrie materialer inkluderer injiserbare fluorescerende sonder, engangssprøyter og 27 G nåler for intravenøs injeksjon av halen.
- Prosedyre
- Bedøv musen i induksjonskammeret med en dose på 2,5 % isofluran og 280 ml/min luft.
- Når musen er bevisstløs, senk anestesien til 1,8 % isofluran og 280 ml/min luft, koble anestesirøret til hodeholderen, og overfør dyret raskt til varmeputen og plasser nesen inne i hodeholderen.
- Immobiliser hodet i hodeholderen ved å bruke skruene.
- Plasser en dråpe kunstig tåre gel på begge øynene for å forhindre tørking.
- På dette tidspunktet injiserer du intravenøst fluorescerende sonder gjennom halevenen og bildet umiddelbart etter.
- Vipp hodet, stikk øyet forsiktig ut av stikkontakten, og fest det med tang og på plass under målet.
- Påfør en sjenerøs mengde kunstig tåre gel for å fylle mellomrommet mellom hornhinnen og målet og fokusere på leveren sfæroider gjennom okularet.
MERK: Hvis mulig, fjern okularet på et av okularene for å få ikke-forstørret syn og lettere finne sfæroidene på iris. - For å oppnå høyoppløselig avbildning til tross for dyrets pustebevegelser, bruk 25x mål og følgende bildeinnstillinger: format 512 x 512 piksler, skannehastighet på 600 Hz og en Z-stacktykkelse på 3 μm. Se detaljerte bildeinnstillinger i tabell 2.
MERK: Gjennom avbildningen justeres anestesikonsentrasjonen fra 1,6-2,2 ml / t isofluran for å oppnå en grunne, kontrollert pusterytme og dermed minimere bevegelsen av dyret. - På slutten av bildebehandlingen, behandle de avbildede øynene med vaselin øyesalve før du fjerner isofluran og vekker dyret.
Representative Results
Primære leverceller, beriket for hepatocytter, ble isolert fra museleveren ved to-trinns kollagenase perfusjon, ved hjelp av en peristaltisk pumpe for å sirkulere varme buffere gjennom leveren ved å utnytte organets vaskulatur for å levere dissosiasjonsenzymer til alle celler (figur 1A). For dette ble den dårligere vena cava kanylert, og portalvenen ble klippet for å tillate gjennomstrømning av buffere (figur 1B). Først ble en HBSS-basert buffer skyllet gjennom leveren for å tømme blodet. Hvis kanyleringen er vellykket og det ikke er blodpropper, blanches leveren og blir gul i løpet av få sekunder. For det andre ble en fordøyelsesbuffer inneholdende Liberase-enzymblandingen sirkulert gjennom leveren for å dissosiere vevet til en enkeltcellesuspensjon. Cellene ble manuelt talt og sådd i 96-brønns ULA-plater (ultra-low adherence), som muliggjør selvmontering i sfæroider innen få dager. På dag 5 dannes sfæroidene, og den tynne kapselen som grenser til sfæroidene indikerer vellykket aggregering (figur 1C). Vi venter til dag 10 med transplantasjon, da sfæroidene er kompakte og har utviklet sterke celle-celleforbindelser. Antall frøceller per brønn bestemte størrelsen på leversfæroiden, med henholdsvis 1000, 1200 og 1500 celler / brønnavgivende sfæroider på 238 μm ± 10 μm, 248 μm ± 17 μm og 298 μm ± 19 μm (gjennomsnittlig ± SD) diameter (figur 1C, D). For transplantasjon velger vi sfæroider med ca. 250 μm diameter av følgende grunner: (1) sfæroidstørrelsen bør ikke være for stor for å unngå hypoksi og nekrotisk kjerne, men bør inneholde nok celler til å støtte cellekommunikasjon og for å tillate remodellering av transplantat i øyet, (2) vekten av sfæroider av denne størrelsen tillater dem å gravitere mot iris og forbedre deres engraftment, (3) Denne størrelsen er passende i forhold til transplantasjon av 5-10 sfæroider per museøye.
Transplantasjonskirurgien krever en manuell-gjenget sprøyte koblet til en glasskanyle (figur 2A). Glasskanylen består av en borosilikatglasskapillær modifisert internt for å ha en fin, stump spiss ved hjelp av en mikropipettetrekker og faveler. En enklere alternativ kanyle kan lages ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig plastkateter koblet til sprøyteslangen og stabiliseres i en pipettespiss (figur 2B). Operasjonen består av inokulering av leversfæroider i ACE gjennom et snitt i hornhinnen (figur 2C). Sfæroidene ble plassert på kantene til eleven for å gjøre dem bedre tilgjengelige for avbildning og unngå at de beveger seg inn i okularvinkelen. Albinomus ble brukt til transplantasjon, da deres ikke-pigmenterte iris tillater in vivo-avbildning av de transplanterte leversfæroidene. Mottakermus ble transplantert i begge øyne med 7-10 sfæroider/øye, og stereoskopiske bilder ble tatt 3 dager etter transplantasjonen (post-Tx) samt 1 uke og 1 måned etter Tx for å dokumentere suksess med hornhinnetilheling og sfæroid engraftment (figur 2D). Merk at endringen i utseendet til leversfæroidene i ACE mellom når nytransplantert og fullt innpodet skyldes oppgjør av transplantatet på iris, samt veksten av et monolag av irisceller over sfæroiden. Suksessraten for transplantasjon av leversfæroider i ACE er 70 % (n = 9 øyne hos både hann- og hunnmus) (figur 2E). De første dagene etter Tx er de mest kritiske for overlevelse og engraftment, sannsynligvis på grunn av at mottakerdyret gnir øynene og løsner sfæroidene før hornhinnen har helbredet. Størrelsen på leversfæroidene varierer ikke signifikant etter Tx, og endringer i form tilskrives remodellering av transplantat og engraftment (figur 2F). 1 måned etter Tx var alle innpodede sfæroider på iris vaskulariserte og innerverte, som vist ved immunfluorescensfarging (figur 2G).
Ikke-invasiv in vivo-avbildning utføres på bedøvede mottakermus ved hjelp av et oppreist konfokalmikroskop og langdistanse dyppemål (figur 3A, tabell 2). Fluorescensavbildningen i ACE kan oppnås gjennom forskjellige tilnærminger, som vist i figur 3B. Injeksjonen av fluorescerende sonder i sirkulasjonen av mottakermusen tillater visualisering av forskjellige celletyper og strukturer i sfæroidene. Vi brukte lektin for å markere blodkar (figur 3C), CMFDA for å observere gallecanaliculi-nettverket (figur 3D) og pHrodo-LDL, som bekreftet aktivt LDL-opptak i sfæroide celler (figur 3E). Lever sfæroider generert fra reporter musemodeller kan også brukes. Albumin-Cre: tdTomato sfæroider tillot merking og sporing av hepatocytter (figur 3F), og sfæroider som uttrykker biosensoren Fluorescent Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) ble brukt til å visualisere cellesyklusdynamikk ved enkeltcelleoppløsning (figur 3G). Endelig kan leversfæroider genmodifiseres in vitro før transplantasjon, og ved adenoassosiert virus (AAV)-GFP-transduksjon ble uttrykket observert in vivo i over 6 måneder (figur 3H).
Figur 1 Isolering av primære musehepatocytter og generering av leversfæroider. (A) Materiale og utstyr som brukes til isolering av primære musehepatocytter: 1. Isolasjonsbuffere; 2. Vannbad; 3. Peristaltisk pumpe; 4. Petri parabolen; 5. Celle sil; 6. Absorberende pute; 7. Disseksjonsmatte; 8. Cell løfter; 9. Butterfly nål 27 G; 10. Disseksjon verktøy. (B) Bukhulen under operasjonen: vena cava er kanylert og perfundert, og portalvenen er klippet for å tillate gjennomstrømning av bufferne. (C) Brightfield-bilder av dannelsen av hepatiske sfæroider in vitro ved 0 (d0), 5 (d5) og 10 (d10) dager etter såing, skalastenger = 200 μm. (D) Leversfæroidstørrelse ved forskjellige cellesåingskonsentrasjoner, n = 21 sfæroider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Transplantasjon og transplantasjon av leversfæroider i ACE hos mus. (A) Materialer og utstyr som brukes til transplantasjon (Tx) av leversfæroider i ACE: 1. Lever sfæroider i kultur parabolen; 2. Steril saltvann; 3. Øyesalve; 4. Nåler 23 g; 5. Kanyle; 6. Hamilton sprøyte; 7. Anestesi gassrør; 8. Hodeholder og gassmaske; 9. Varmepute; 10. Skreddersydd metallbunnplate; 11. Tang og solid universalledd. (B) Oppsett av kanyle og Hamilton sprøyte: 1. Glasskanyle koblet til Hamilton-sprøyten via Portex-slange og en 27G kanyle; 2. Glasskanyle er koblet til Portex-røret via ytterligere segmenter av silikonrør og PharMed-rør; 3. Alternativ montert plastkanyle; 4. Deler som danner plastkanylen: 24G BD Insyte plastkateter koblet via PharMed-rør og kledd i en avskåret 10 μl pipettespiss for stabilitet og grep. (C) Illustrasjon av trinn i Tx-kirurgi: 1. Sfæroidene samles inn i kanylen; 2. Hornhinnen punkteres med en nål; 3. Kanylen settes inn i snittet, og sfæroidene slippes ut i ACE; 4. Fra utsiden av øyet er sfæroidene plassert nær eleven og vekk fra snittet. (D) Stereoskopiske bilder av leversfæroider (sph) i museøyet på operasjonsdagen og ved 3-, 7- og 30-dager etter Tx. Pilene indikerer levedyktige sfæroider. (E) Lever sfæroid (størrelse på 1200 celler / brønn) engraftment rate post-Tx, n = 9 øyne i 6 mottakermus. (F) Størrelse på leversfæroider i kultur, før transplantasjon (in vitro, n = 20 sfæroider fra enkeltpreparat) og 1 måned etter Tx i ACE (in vivo, n = 16 sfæroider i 3 mottakermus), beregnet ved gjennomsnittlig vertikal og horisontal diameter. (G) Immunfluorescensfarging av transplanterte leversfæroider 2 måneder etter Tx, som viser vaskularisering (CD31, rosa, stiplet linje avgrenser sfæroidmassen) og sympatisk innervering (tyrosinhydroksylase (TH), oransje), skalastang = 100 μm. Data for panel F er tilpasset med tillatelse fra Lazzeri-Barcelo et al.10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Ikke-invasiv intraokulær in vivo avbildning av transplanterte leversfæroider. (A) Materiale og utstyr som brukes til in vivo ACE-avbildning: 1. Oppreist laserskanning konfokalmikroskop; 2. Mørk boks; 3. Motorisert XYZ scenen; 4. Dipping-mål; 5. Hodeholder og gassmaske; 6. Tang og solid universalledd; 7. Varmepute; 8. Skreddersydd metallbunnplate. (B) Diagram som viser ulike tilnærminger brukt til in vivo-avbildning av fluorescerende avlesninger i leversfæroider innpodet i øyet. (VG Nett) Representative bilder av ACE-lever sfæroider under in vivo avbildning ved konfokal mikroskopi. Backscatter-signalet brukes til å observere sfæroidvolumet og strukturen; (C) Blodkar merket med i.v. injeksjon av fluorescerende lektin, skalastang = 100 μm; (D) Galle canaliculi nettverk merket ved injeksjon av fluorescerende CMFDA, skala bar = 50 μm; (E) LDL-opptak ved injeksjon av fluorescerende pHrodo-LDL-sonde, skala bar = 100 μm; (F) Td-tomatuttrykkende hepatocytter, pilspisser indikerer kjerner og stjerner indikerer intra-sfæroid vaskulatur, skala bar = 50 μm; (G) Overvåking av cellesyklusdynamikk i FUCCI-uttrykkende leversfæroider, skalastenger = 50 μm (hovedbilde) og 20 μm (oppblåsning). (H) leversfæroider transdusert in vitro med AAV8-GFP før Tx og avbildet i øyet 6 måneder etter Tx, skala bar = 50 μm. Bildet i panel G er tilpasset med tillatelse fra Lazzeri-Barcelo et al.10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Løsninger som brukes til isolering av primære hepatocytter fra mus. Sammensetning av løsninger og buffere som trengs for isolering av hepatocytt fra mus. Komponentene for fordøyelsesbuffer og gradientoppløsning skal blandes ferske på isolasjonsdagen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2. Confocal Leica SP5 mikroskopinnstillinger som brukes til intraokulær in vivo avbildning av leversfæroider. Tabellen er bearbeidet med tillatelse fra Lazzeri et al.10. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Denne protokollen beskriver en ny plattform for intraokulær in vivo avbildning av leversfæroider innpodet i ACE. ACE har tidligere blitt brukt som transplantasjonssted for andre organavledede mikrovev, for eksempel bukspyttkjerteløyer11,12, på grunn av sitt unike engraftmentmikromiljø, som er rik på kar, nerver og oksygen, og tilgangen til avbildning gjennom hornhinnen. Mens intravital leveravbildning muliggjør visualisering av celler og prosesser in situ, er langsgående overvåking ikke mulig. Leveravbildning gjennom et bukvindu innebærer komplisert kirurgi, og bevegelsen av organet i kroppen gjør enkeltcellesporing over tid vanskelig. Derfor muliggjør denne nye bildebehandlingsmetoden ikke-invasiv, langsgående overvåking av leverceller ved enkeltcelleoppløsning.
Denne protokollen er delt inn i tre deler. Først er isoleringen av primære hepatocytter via to-trinns kollagenase perfusjon, tilpasset fra Charni-Natan et al.13, med den forskjellen at vi utfører leverperfusjonen på den døde musen i stedet for de bedøvede levende dyrene. Denne variasjonen gir visse fordeler, for eksempel færre etiske hensyn og unngåelse av anestesirester i organismen. I dette arbeidet genererer vi leversfæroider fra den hepatocytberikede fraksjonen av isolasjonen, men dette utelukker ikke potensialet for å isolere andre ikke-parenkymale cellepopulasjoner ved hjelp av andre spesialiserte protokoller for å lage kokultursfæroider med forskjellig sammensetning14,15.
Den andre delen av denne protokollen innebærer transplantasjon av leversfæroidene i ACE hos mottakermus. Dette er en rask (under 10 min) og enkel kirurgi utført i bedøvede mus og krever ingen postoperativ behandling. Hornhinnen punkterer seg selv og helbreder over 3-5 dager. Av og til, under helbredelsesprosessen, observeres noe tåke rundt snittet, men dette rydder innen få dager. Vi har ikke opplevd tilfeller av fremre synechia i øynene til opererte dyr. Vi utfører transplantasjonsprosedyrene i et rent, men utendørs laboratorium og uten problemer med infeksjoner i de opererte øynene. Inokulering og engraftment av sfæroider i øyet kompromitterer ikke visjonen eller endrer mottakerdyrets oppførsel. I denne protokollen bruker vi isoflurananestesi både til transplantasjonskirurgi og in vivo avbildning, noe som tolereres godt hos mus. På grunn av sin doseavhengige effekt kan den enkelt justeres gjennom prosedyrene og gir fordelen av å redusere søvn- og oppvåkningstider. Imidlertid kan alternative injiserbare anestetika brukes. Etter transplantasjon tillater vi vanligvis 1 måned for sfæroidene å fullstendig engraft, bli vaskularisert og innervert, før vi utfører behandlingsintervensjoner og in vivo avbildning. Vi har også vist at transplantasjon og transplantasjon er mulig ved bruk av humane leversfæroider og immunkompromitterte mottakermus10.
Den tredje delen av denne metoden er in vivo-avbildning av de transplanterte leversfæroidene i ACE. Denne protokollen beskriver in vivo bildeoppsettet, som bruker mikroskopiutstyr som ofte finnes i forskningsbildeanlegg. Videre er de spesialiserte materialene, som musehodeholderen og plastkanylen, nå kommersielt tilgjengelige. Med dette bildeoppsettet er vi i stand til å fange z-seksjoner og få en tredimensjonal rekonstruksjon av sfæroidarkitekturen, avhengig av dybden av laserpenetrasjon og fluorescensdeteksjon. Overvåking av cellulær funksjon i de transplanterte leversfæroidene er avhengig av visualisering av fluorescerende proteiner som rapporterer om celletyper, cellulære funksjoner og dynamikk. Dermed kan denne bildebehandlingsplattformen utnyttes ved hjelp av forskjellige modaliteter, alene eller i kombinasjon: (1) Fluorescerende prober kan administreres intravenøst, for eksempel antistoffer mot etikett og sporceller samt funksjonelle fargestoffer; (2) Leversfæroider kan genereres fra celler isolert fra reportermusemodeller som uttrykker leverspesifikke fluorescerende proteiner, for eksempel FUCCI leversfæroider som rapporterer om cellesyklusdynamikk; (3) Dannelsen av leversfæroider in vitro kan kombineres med transfeksjon eller transduksjon for å utstyre sfæroidene med fluorescerende proteiner og biosensorer. f.eks. adenoassosierte virus. I våre eksperimentelle omgivelser og ved å bruke et enkelt foton for eksitasjon, er bildedybden som er mulig å oppnå omtrent 60-100 μm. Dette er imidlertid avhengig av tilgjengeligheten av laserkraft og multifotonbilde, utslippsegenskaper for fluorescenssonden og følsomheten til detektorene, samt vinkelen på øyet der sfæroiden er innpodet. Etter bildeinnsamling kan nedstrøms bildeanalyse utføres ved hjelp av populære programmer som Image J og Imaris. For eksempel, når det gjelder FUCCI-reporteren, kan cellesyklusaktive celler i grønt telles og kontrasteres til antall totale røde blodlegemer for å vurdere cellesyklusaktivitet i den transplanterte sfæroiden. I tillegg tillater ACE-bildebehandlingsplattformen at stoffer påføres øyet (i form av øyedråper) eller injiseres direkte i ACE for å behandle transplantatet og overvåke dets reaksjon. Post-mortem kan de transplanterte sfæroidene lett hentes ved manuell mikrodisseksjon og kan gi verdifull informasjon ved ex vivo-teknikker , for eksempel immunfluorescensfarging, transkriptomisk analyse, etc.10.
Denne teknikken har visse begrensninger. Den første er at fra vår erfaring må mottakermusene være albino, det vil si ha ikke-pigmentert iris. Ved engraftment blir leversfæroidene dekket av et monolag av irisceller, noe som ikke påvirker levedyktigheten eller funksjonen til sfæroidene, men pigmentet i iriscellene forhindrer avbildning. En annen vurdering er stabiliteten under intraokulær avbildning i bedøvede mus. Under in vivo-avbildningsøktene må anestesikonsentrasjonen og pusten til dyret overvåkes nøye for å minimere bevegelse. Likevel, ved å bruke bildeinnstillingene som er angitt her, er vi i stand til å oppnå høyoppløselig bildebehandling på enkeltcellenivå.
For å oppsummere, beskriver denne protokollen implementeringen av en ikke-invasiv in vivo bildebehandlingsplattform av leverlignende vev innpodet i musens øyne. Vi bruker enkle prosedyrer, felles utstyr og rimelige materialer, noe som gjør det til en oppnåelig tilnærming for mange etterforskere. Denne modellen kombinerer fordelene med in vitro 3D-leversfæroider med in vivo-miljøet og optisk tilgjengelighet levert av ACE for å skape en verdifull plattform for å studere leverfysiologi og patologi i grunnforskning og prekliniske omgivelser.
Disclosures
P-OB er medstifter og administrerende direktør i Biocrine AB, IBL, og BL er konsulenter for Biocrine AB.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Diabetesforbundet, Karolinska Institutets fond, Vetenskapsrådet, Novo Nordisk-stiftelsen, Familien Erling-Persson Foundation, Strategisk forskningsprogram i diabetes ved Karolinska Institutet, Familien Knut og Alice Wallenberg-stiftelsen, Jonas & Christina af Jochnick-stiftelsen, Svensk forening for diabetologi og ERC-2018-ADG 834860-EYELETS. Figurtegningene ble laget av FL-B ved hjelp av BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
| AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
| Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
| Absorbent pad | Attends | 203903 | |
| Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
| BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
| Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
| Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
| FBS | Gibco | N/A | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
| Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
| HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
| Isoflurane | Baxter | N/A | |
| Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
| Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
| Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
| Oculentum simplex | APL | N/A | |
| PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
| PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
| PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
| pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
| Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
| Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
| Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
| Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
| Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
| Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
| Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
| Viscotears | Novartis | N/A | |
| William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |
References
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Sci Rep. 6, 25187 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Oliva-Vilarnau, N., Vorrink, S. U., Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. A 3D cell culture model identifies Wnt/beta-catenin mediated inhibition of p53 as a critical step during human hepatocyte regeneration. Adv Sci (Weinh). 7 (15), 2000248 (2020).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Sci Rep. 8 (1), 14297 (2018).
- Lauschke, V. M., Shafagh, R. Z., Hendriks, D. F. G., Ingelman-Sundberg, M. 3D primary hepatocyte culture systems for analyses of liver diseases, drug metabolism, and toxicity: Emerging culture paradigms and applications. Biotechnol J. 14 (7), e1800347 (2019).
- Shibuya, K., et al. The efficacy of the hepatocyte spheroids for hepatocyte transplantation. Cell Transplant. 30, 9636897211000014 (2021).
- Hamazaki, K., Doi, Y., Koide, N. Microencapsulated multicellular spheroid of rat hepatocytes transplanted intraperitoneally after 90% hepatectomy. Hepatogastroenterology. 49 (48), 1514-1516 (2002).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Lazzeri-Barcelo, F., et al. Intraocular liver spheroids for noninvasive high-resolution in vivo monitoring of liver cell function. Nat Commun. 15 (1), 767 (2024).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Baze, A., et al. Three-dimensional spheroid primary human hepatocytes in monoculture and coculture with nonparenchymal cells. Tissue Eng Part C Methods. 24 (9), 534-545 (2018).
- Mohar, I., Brempelis, K. J., Murray, S. A., Ebrahimkhani, M. R., Crispe, I. N. Isolation of nonparenchymal cells from the mouse liver. Methods Mol Biol. 1325, 3-17 (2015).
