Summary
Apresentamos uma nova abordagem para microscopia de dois fótons da liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro marcadas fluorescente para glioblastoma em um modelo de camundongo.
Abstract
A administração intravenosa de terapêutica do câncer para tumores cerebrais é limitada pela barreira hematoencefálica. Um método para obter imagens diretas do acúmulo e distribuição de macromoléculas em tumores cerebrais in vivo aumentaria muito nossa capacidade de entender e otimizar a liberação de fármacos em modelos pré-clínicos. Este protocolo descreve um método para rastreamento in vivo em tempo real de nanopartículas fluorescentes marcadas por via intravenosa com microscopia intravital de dois fótons (2P-IVM) em um modelo de glioblastoma (GBM) em camundongos.
O protocolo contém uma descrição do procedimento em várias etapas, incluindo anestesia e analgesia de animais experimentais, criação de uma janela craniana, implante de células GBM, colocação de uma barra de cabeça, realização de estudos de 2P-IVM e cuidados pós-cirúrgicos para estudos de seguimento de longo prazo. Mostramos sessões representativas de imagens 2P-IVM e análise de imagens, examinamos as vantagens e desvantagens dessa tecnologia e discutimos possíveis aplicações.
Este método pode ser facilmente modificado e adaptado para diferentes questões de pesquisa no campo da imagem cerebral pré-clínica in vivo .
Introduction
A microscopia intravital de dois fótons (2P-IVM) é uma técnica de imagem por fluorescência que permite a visualização de tecidos vivos1.
Desenvolvida pela primeira vez na década de 1990, a 2P-IVM tem sido utilizada para análise in vivo da retina2, rim3, intestino delgado4, cóclea5, coração6, traqueia7 e cérebro em vários modelos pré-clínicos 8,9. No campo da neurociência, a 2P-IVM tem ganhado importância como técnica de obtenção de imagens em tempo real do cérebro saudável em animaisacordados10, além de estudar doenças do sistema nervoso comoAlzheimer11,Parkinson12 e glioblastoma (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM oferece uma solução elegante para estudar o microambiente tumoral durante o desenvolvimento do GBM. Enquanto alguns estudos anteriores se concentraram em modelos in vitro17 e ex vivo 18, outros implementaram modelos ortotópicos19 e xenotrópicos20 in vivo para examinar GBM. Madden e col. realizaram imagens nativas da linhagem celular de glioma de rato CNS-1 em um modelo de camundongo13. Ricard e col. realizaram a administração intravenosa de um fluoróforo para realçar os vasos sanguíneos na região tumoral em 2P-IVM, utilizando um modelo murino ortotópico GL261-DsRed14.
Aqui, aplicamos 2P-IVM para rastrear a liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro (NP) marcadas fluorescentes em um modelo ortotópico de GBM em camundongos. Usando uma janela craniana, este método nos permite estudar a distribuição espaço-temporal em tempo real de NPs no cérebro em detalhes.
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Protocol
O procedimento animal descrito neste protocolo está de acordo com as exigências do Painel Administrativo de Cuidados com Animais de Laboratório (APLAC).
1. Cultura celular
- Preparação do exaustor
- Lave as mãos, use luvas e jaleco. Ligue o armário de segurança biológica e ajuste o nível da faixa para uma altura de abertura apropriada. Deixe o capuz purgar por 3-5 min. Borrife a área da coifa com etanol 70% e limpe-a com papel higiênico.
- Borrife todos os reagentes com etanol 70% e limpe com papel higiênico. Mova os reagentes para o capô. Não coloque nenhum item na grelha. Se ocorrer um derramamento no capuz, cubra-o com lenços umedecidos, borrife com etanol 70% e limpe novamente.
- Após o experimento, feche cuidadosamente as tampas de cada item, limpe todos os materiais, remova todos os itens do capô e transfira-os para o local original. Borrife etanol 70% no capô e limpe-o. Feche a faixa e desligue o armário de segurança biológica.
- Preparação de um meio de crescimento
- Adicionar 50 mL de soro fetal bovino (SFB) a 500 mL de meio Dulbecco's Modified Eagle (DMEM). Adicionar 5 mL da solução antibiótico-antimicótica (100x).
- Passar todos os reagentes através de um frasco filtrante estéril de 500 ml (filtro de 0,22 μm).
- Descongelamento de células criopreservadas
- Em uma capela de fluxo laminar, adicionar 20 mL do meio de crescimento a um balão T75. Rotular o balão com o nome das células, data e número de passagem no frasco. Neste estudo, células de glioma C6 aderentes foram utilizadas.
- Descongele as células rapidamente em banho-maria a 37 °C. Não vórtice as células. Descongele e use imediatamente as células.
- Transferir as células descongeladas para o frasco T75 com uma ponteira de pipeta de 1 ml. Tenha cuidado para não introduzir bolhas durante o processo de transferência e evite qualquer resíduo médio no colo do frasco. Isso poderia aumentar o risco de possível contaminação.
- Mudando o meio
- Alterar o meio no dia seguinte ao descongelamento para remover qualquer tripsina residual ou dimetilsulfóxido (DMSO) (passo 1.6). Depois, troque o meio pelo menos duas vezes por semana ou mais, dependendo do nível de confluência celular. O meio deve ser trocado um dia após a passagem para eliminar a tripsina.
- Para trocar o meio, ligue o aparelho de aspiração, prenda a pipeta de vidro de aspiração e aspirar todo o meio.
- Adicionar 20 ml do meio de cultura (passo 1.2).
- Passando as células
- Carregue o capô com os itens necessários no decorrer do experimento.
- Use uma pipeta de vidro de aspiração e aspirar todos os meios, garantindo que a pipeta de vidro esteja no lado não celular do frasco. Para esta etapa, posicione o frasco T75 verticalmente.
- Adicionar ~10 mL de solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente (TR) (livre de PBS, Ca++ e Mg++ ) ou solução salina balanceada de Hanks (livre de HBSS, Ca++ e Mg++ ) no lado não celular. Lavar brevemente as células com PBS, posicionando o frasco T75 horizontalmente com o lado da célula virado para baixo.
- Colocar imediatamente o frasco verticalmente e aspirar o PBS/HBSS. Repita esta lavagem e aspiração 3 vezes.
- Adicionar 2 ml de tripsina (recombinante ou de origem animal) no lado da célula (balão T75 horizontal, lado da célula virado para baixo). Incubar em uma incubadora padrão de cultura de tecidos (37 °C, 5% CO2) por 4 min. Triturá-lo uma vez após 2 min usando uma pipeta de 5 mL.
- Após 4 min de incubação total, transferir a solução para um tubo cônico de 15 mL. Adicionar 8 mL da solução de crescimento ao tubo cônico (2 mL de células tripsinizadas + 8 mL de meio = 10 mL no total).
- Use outro tubo cônico vazio de 15 mL com um filtro e transfira as células através de uma pipeta de 25 mL para obter células individuais.
- Transferir 1/10 (1 mL) da solução (célula + meio + Tryp-LE) para um frasco T75 com 20 mL de meio. Como alternativa, conte as células (etapa 1.7). Altere a mídia no dia seguinte para ter uma solução de mídia sem tripsina.
- Congelamento do meio e das células
- Descongele 100% FBS em geladeira a 4 °C. Não use banho-maria ou calor, pois isso pode danificar as proteínas no FBS.
- Para preparar 50 mL de meio de congelamento, misturar 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS e 5 mL de DMSO. Aliquot para recipientes de 1-2 mL para evitar o descongelamento intermitente e danos às proteínas. Armazená-los em congelador de -20° ou -80°C.
- Para os restantes 9 ml de solução (passo 1.5), adicionar 1 ml de meio para atingir 10 ml no total. Centrifugar a 300 x g por 4 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de meio de congelação (ver acima). Coloque as células num recipiente de congelação num congelador a -80 °C. Mover as células para o líquido N2 para armazenamento a longo prazo após 1 ou 2 dias.
- Contando as células
- Para os 9 mL restantes (passo 1.5), adicionar 1 mL de mídia para atingir 10 mL no total. Centrifugar a 300 x g por 4 min.
- Retirar o sobrenadante e ressuspender em 4 mL de HBSS. Ressuspender 10 μL de células em 80 μL de HBSS + 10 μL de Azul de Tripano a 0,4%, fator de diluição = 10.
- Tome 17 μL da solução e conte quatro quadrados 4 x 4 em um hemocitômetro. Contagens médias para os quatro quadrados 4 x 4 e multiplicar por 104x fator de diluição para obter células/mL.
2. Cirurgia
OBS: Recomenda-se a realização da cirurgia por dois pesquisadores, onde uma pessoa é responsável por preparar as células, misturar o cimento dentário e, geralmente, auxiliar no procedimento, enquanto a segunda pessoa se concentra em permanecer estéril. Ter um segundo manipulador para auxiliar no procedimento cirúrgico reduz consideravelmente a probabilidade de ocorrer contaminação. Seguir as melhores práticas cirúrgicas reduziria as chances de complicações pós-operatórias. A Figura 1A fornece uma visão geral dos componentes da janela craniana.
- Preparativos gerais
- Confirme se o procedimento é aprovado pelas diretrizes institucionais locais de bem-estar animal antes de começar.
NOTA: Este estudo utilizou camundongos NSG fêmeas de 5 meses de idade (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5). - Antes da cirurgia, autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e certifique-se de que todos os suprimentos necessários estejam disponíveis. Imprima os registros de anestesia e cirurgia.
- Certifique-se de que, na chegada, os animais tenham pelo menos 1 semana de aclimatação à sala de criação de animais para reduzir o sofrimento pós-operatório adicional.
- No dia da cirurgia, certifique-se de que todos os dispositivos (microscópio, almofada de aquecimento, esterilizador, furadeira, vácuo, etc.) estejam prontos para uso. Confirme se o aparelho de anestesia contém isoflurano suficiente e reabasteça, se necessário. Para novos usuários, o procedimento de janela craniana pode levar até 2 h por animal; portanto, ter isoflurano suficiente é crucial.
- Coloque as janelas de vidro e as barras da cabeça em álcool e prepare um recipiente com soro fisiológico. Isso garantirá um fluxo de trabalho tranquilo sem grandes violações na esterilidade e manterá o tempo sob anestesia para cada animal o mais curto possível.
- Abra todos os materiais cirúrgicos em uma superfície estéril na estação de trabalho. Por exemplo, o interior de uma embalagem de gaze estéril pode ser usado para este fim. Use a técnica somente de pontas. Quando não estiver usando instrumentos cirúrgicos, coloque as pontas em uma superfície estéril, como o interior da embalagem de gaze estéril.
- Ao realizar múltiplas cirurgias, coloque todos os instrumentos cirúrgicos no esterilizador entre as cirurgias para desinfetá-los. Ao realizar cirurgias em mais de 5 animais, utilizar um novo conjunto de instrumentos autoclavados. Troque a ponta da broca quando ela se tornar romba por uma nova para evitar trauma tecidual.
- Confirme se o procedimento é aprovado pelas diretrizes institucionais locais de bem-estar animal antes de começar.
- Anestesia e preparações para a cirurgia
NOTA: O arranjo da anestesia é idêntico para a cirurgia, bem como para exames de imagem.- Anestesiar o camundongo com isoflurano (3%-5% para indução) em câmara anestésica. Depois de garantir a profundidade anestésica adequada, testando o reflexo de retirada do pedal (pinça da almofada do pé em ambas as patas traseiras), transfira o animal para uma estação de trabalho de preparação. Manter a anestesia sobre um cone nasal (1%-2%). Aqui, aplique uma pomada ocular para evitar danos na córnea. Controle regularmente a perda de reflexos durante a cirurgia, verificando o reflexo da pata.
- Se for necessária alguma identificação do animal, use uma ferramenta de perfuração de orelha ou tesoura para marcar as orelhas ou use um marcador para marcar a cauda.
- Retire o pelo que cobre o crânio entre as orelhas e os olhos com um creme depilatório. Deixe o creme pelo tempo indicado (30-60 s) pelo fabricante para evitar irritação da pele. Certifique-se de que o creme entra em contato com as raízes do cabelo, aplicando-o contra a direção do crescimento do cabelo. Evite que o creme depilatório entre em contato com os olhos. Remova qualquer creme e restos de cabelo limpando a área com soro fisiológico. Como alternativa, use cortadores.
- Para evitar qualquer dor, infecção ou inchaço intra e pós-operatório, administrar anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), opioides, anti-inflamatórios e antibióticos. Administrar carprofeno (5-20 mg/kg, subcutâneo [SQ]), buprenorfina - liberação sustentada (1 mg/kg SQ), cefazolina (20 mg/kg SQ) e dexametasona (0,2 mg/kg SQ) antes da cirurgia. Administrar aproximadamente 0,3 mL de soro fisiológico a 0,9% para evitar desidratação.
- Em seguida, esfregue a área alternadamente esfregando iodopovidona e álcool isopropílico três vezes em movimentos circulares do meio do crânio para a periferia.
- Procedimento de craniotomia
- Transfira o animal para a mesa cirúrgica e coloque-o em decúbito ventral sobre uma almofada de aquecimento (~37 °C) para garantir condições isotérmicas durante o procedimento. A hipotermia em roedores reduz significativamente as taxas de sobrevida e prolonga a fase de recuperação pós-operatória.
- Coloque a cabeça na armação estereotáxica posicionando as barras auriculares e as barras dos incisivos. Para as barras auriculares, encontre o arco zigomático e insira as barras atrás dos arcos. Comece por prender a barra contralateral com a mão dominante (por exemplo, prenda a barra esquerda com a mão direita se for destro) e, em seguida, prenda o lado oposto. Ajuste as posições da orelha e das barras dos incisivos girando os parafusos, se necessário.
- Reaplique pomada ocular, se necessário, e use um pedaço de papel alumínio para cobrir os olhos. Isso evitará qualquer dano causado pela luz brilhante do microscópio e pela luz UV usada para curar a cola de cianoacrilato mais tarde (passo 2.5).
- Antes da incisão, verifique novamente se há reflexo de pinça dos dedos; Se necessário, ajuste a anestesia de acordo. Conecte o animal ao dispositivo de monitoramento da anestesia posicionando o sensor na pata traseira. Medir a frequência cardíaca e a concentração de oxigênio no sangue ajudaria a reduzir a mortalidade e melhorar a recuperação pós-operatória. Além disso, adquira a frequência respiratória inspecionando visualmente o movimento torácico.
- Cubra o corpo do animal com um pano para evitar hipotermia e contaminação. Realizar um último swab de iodopovidona antes de iniciar a cirurgia.
- Coloque luvas e um jaleco limpo.
NOTA: O uso de luvas estéreis é encorajado devido à invasividade do procedimento e para diminuir o risco de qualquer infecção e inflamação pós-operatória resultando em morbidade e perda da qualidade da imagem em 2P-IVM (seção 5). - Levante a pele do crânio e crie uma incisão segurando a tesoura entre o olho direito e a orelha e cortando para o lado esquerdo do crânio seguindo as marcas da incisão. Remova o retalho de pele redondo resultante.
NOTA: Dependendo da região de interesse no cérebro e do tamanho da janela, o local e o diâmetro da incisão podem variar. O tamanho da incisão precisa ser maior que o diâmetro da cabeça para acomodar espaço para montagem (passo 2.5). Se necessário, a pele ao redor da incisão pode ser suavemente dissecada para criar mais espaço. - Remova o periósteo coçando suavemente a superfície do crânio com uma lâmina de bisturi ou um microcurrete. Tenha cuidado ao remover o periósteo ao redor das suturas cranianas, pois essas áreas são frágeis e mais propensas a sangramentos. Use soro fisiológico e vácuo para manter a área cirúrgica limpa de detritos. Riscar o periósteo para garantir melhor aderência à cola de cianoacrilato e ao cimento dentário (passo 2.5)
- Identificar a região do cérebro para realizar a injeção de células. Para isso, use um atlas das coordenadas estereotáxicas do cérebro do rato. De acordo com as coordenadas cerebrais, marque a posição da janela craniana usando um punch de biópsia no mesmo diâmetro da janela, uma caneta cirúrgica ou um lápis autoclavado.
- Segure a broca na mão dominante e qualquer outro instrumento (seringa, pinça) na mão não dominante. Evite perfurações prolongadas no mesmo local. A broca deve ser usada em rajadas para evitar superaquecimento. Durante essas pausas, aplique soro fisiológico gelado no calvário para manter a visão cirúrgica limpa e evitar o superaquecimento. Use o feedback sensorial da ponta da broca para detectar quando o crânio foi perfurado completamente.
- Use soro fisiológico frio, em combinação com um aspirador, para limpar a superfície do crânio. Não use gaze ou aplicador de ponta de algodão após a abertura do calvário, pois restos de fios de algodão podem levar a uma reação de corpo estranho ao selar a janela cerebral.
- Durante a perfuração, certifique-se de que a trajetória e o diâmetro sejam do mesmo tamanho que os da tampa de vidro. Faça isso posicionando a tampa de vidro no topo do crânio e confirmando que a tampa de vidro se encaixará exatamente dentro da janela craniana.
- Uma vez possível deprimir o retalho craniano pressionando-o suavemente, utilizar pinça para remover cuidadosamente o fragmento do campo cirúrgico (Figura 1B, esquerda). Se ainda não for possível deprimir o crânio, continue perfurando as áreas da janela craniana que ainda estão conectadas ao resto do crânio e reavalie.
- Se ocorrer um pequeno sangramento, use uma esponja hemostática combinada com pressão leve ou, alternativamente, soro fisiológico gelado, para ajudar a reduzir a perda de sangue.
- Implantação celular
- Preparar e contar as células a serem implantadas conforme descrito em (etapa 1.7). Certifique-se de que o número de células é de 200.000 células/μL.
NOTA: Recomenda-se suspender as células em uma matriz de membrana que se solidifica em RT. Isso melhorará a taxa de sucesso das células implantadas no parênquima cerebral. - Transfira as células em recipiente com gelo para a sala cirúrgica. Use uma seringa de microlitro estanque ao gás. Antes da aspiração, mantenha a seringa no gelo para evitar diferenças de temperatura.
- Após aspirar 1 μL, posicione a seringa dentro do quadro estereotáxico.
NOTA: Um dispositivo de coordenadas estereotáxicas automatizado mostrando as posições nos eixos X, Y e Z pode ser usado para economizar tempo. Também é possível calcular manualmente as posições com base no lambda. Não é recomendada a injeção de mais de 1,5 μL. Isso garantirá que a área injetada não se encha demais, causando implantação malsucedida, crescimento fora do parênquima cerebral ou metástases. - Realizar implantação na região V2MM (córtex visual 2, parte mediomedial) do cérebro, que corresponde a coordenadas aproximadamente medial a lateral (M-L): -1,2 a -1,6 mm, e dorsal a ventral (D-V): coordenadas -2,6 a -3,5 mm.
- Para a obtenção de imagens com dois fótons (passo 4.6), implantar as células nas áreas superficiais do cérebro para que a massa tumoral possa ser visualizada através da janela craniana posteriormente. Injetar 0,5 μL (100.000 células) de anterior para posterior (A-P): 0,8 mm de profundidade. Movimentar a agulha lentamente, de forma escalonada, ao entrar no cérebro e aguardar 30 s após a injeção (Figura 1B, coluna do meio).
- Use a mesma abordagem ao retrair a agulha e sair do tecido cerebral. Evite injetar perto dos ventrículos, pois o líquido cefalorraquidiano pode favorecer metástases nos sistemas nervoso central e periférico.
- Preparar e contar as células a serem implantadas conforme descrito em (etapa 1.7). Certifique-se de que o número de células é de 200.000 células/μL.
- Fechamento da janela craniana
- Mova a barra principal e a tampa de vidro do álcool para uma solução salina. Use uma ponta de vácuo ou pinça para navegar esses componentes até o local cirúrgico.
- Posicione a tampa de vidro dentro da janela craniana e coloque uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato entre o crânio e a lamínula de vidro. A cola de cianoacrilato ativada por UV reduz o tempo de cura e evita o deslocamento acidental. Se alguma cola derramar na tampa de vidro, remova-a com um aplicador de ponta de algodão ou arranhando-a suavemente com o lado rombo de um bisturi antes de curar completamente.
CUIDADO: A luz UV é prejudicial aos olhos e à pele. Evite o contato com os olhos e a pele durante a cura da cola. - Depois de fixar a tampa de vidro na janela craniana, aplique a barra da cabeça. Misture o cimento dental bicomponente, posicione a barra da cabeça e aplique o cimento na área circundante, garantindo o contato entre o crânio e a barra da cabeça. Limpe cuidadosamente qualquer cimento supérfluo com a ponta de uma seringa, um bisturi ou uma ponta de broca.
NOTA: O cimento dentário solidifica-se muito rapidamente, por isso é aconselhável aplicá-lo em tempo hábil. - Após selar a janela craniana, identifique se alguma área craniana entre o cimento dentário e a pele ainda está exposta. Se esse for o caso, aplique cola cirúrgica para cobrir o crânio, fechando a pele. Alternativamente, realizar uma única sutura com um material de sutura absorvível.
3. Recuperação pós-cirúrgica e crescimento tumoral
- Recuperação
- Monitore o animal em uma almofada aquecida em uma gaiola de recuperação até que ele recupere a consciência plena. Aloja os animais separadamente pós-cirurgia para reduzir o risco de lesões.
- Administrar uma dieta de recuperação, como géis de água comercialmente disponíveis com eletrólitos ou açúcares. Alternativamente, forneça ração de laboratório padrão umedecida para garantir uma nutrição fácil e evitar desidratação e hipoglicemia.
- Monitorização
- Após a recuperação, monitore o animal diariamente em busca de sinais de dor, angústia ou infecção. Se necessário, administre analgésicos, anti-inflamatórios ou antibióticos. Se um animal atingir o ponto final do estudo, eutanasiá-lo humanamente. Após a última sessão de imagem, eutanasiar o camundongo por asfixia por dióxido de carbono, seguido de luxação cervical.
NOTA: Exemplos de critérios de eutanásia precoce incluem, mas não estão limitados a perda de peso significativa (>20%), distúrbios neurológicos, dispneia, sangramento excessivo durante a cirurgia ou comportamento estereotipado pronunciado. Inspecionar a janela craniana e limpá-la com soro fisiológico ou álcool quando necessário. - Para acompanhar o crescimento do tumor e planejar os pontos de tempo de imagem, realize imagens de bioluminescência de corpo inteiro (BLI). Para isso, injetar 150 mg/kg de D-luciferina por via intraperitoneal e fotografar o animal após 5-15 min.
- Após a recuperação, monitore o animal diariamente em busca de sinais de dor, angústia ou infecção. Se necessário, administre analgésicos, anti-inflamatórios ou antibióticos. Se um animal atingir o ponto final do estudo, eutanasiá-lo humanamente. Após a última sessão de imagem, eutanasiar o camundongo por asfixia por dióxido de carbono, seguido de luxação cervical.
4. Síntese de nanopartículas
- Preparação de partículas
- Adicionar 11,17 mL de Ferumoxytol (6 mmol de Fe no total) a uma solução contendo 50 mL de NaOH 5 M, 20 mL de água deionizada (água DI) e 20 mL de epicloridrina. Observe a segregação de fase nesta fase. Incubar a mistura em RT sob agitação suave durante 24 horas.
- Após 24 h, a solução torna-se uniforme. Remova o excesso de epicloridrina usando tubos de diálise (12.000-14.000 Da de corte) contra a água por 3 dias.
- Após a diálise, transferir a solução restante no tubo para um frasco de vidro (volume total ~110 mL). Adicionar 30 ml de hidróxido de amoníaco e agitar a mistura a 37 °C durante 18-20 horas.
- Depois de mexer, repita a diálise contra a água por 3 dias. Transfira a solução restante na tubulação de diálise para um novo frasco de vidro com um volume total de ~110 mL.
- Conjugação de isotiocianato de fluoresceína (FITC)
- Retirar 27,5 mL de partículas funcionalizadas com amina para conjugação FITC. Concentrar as partículas utilizando um filtro de ultracentrifugação de 10 kDa e lavar com um tampão pH 9 (Na2CO3/NaHCO3) a 5752 x g a 25 °C durante 10 minutos.
- Adicionar 4 ml da solução no filtro e ultracentrifugar o tubo a 5752 x g a 25 °C durante 10 minutos. Descarte o filtrado e encha novamente o filtro com tampão para uma segunda rodada de lavagem com o mesmo protocolo.
- Descarte o filtrado e colete a solução no filtro usando uma pipeta. Estimar a concentração molar da partícula pela concentração mássica de Ferumoxytol, assumindo que o diâmetro de cada partícula é de 5 nm.
- Dissolver o FITC em dimetilsulfóxido anidro (DMSO) a 10 mg/mL. Adicionar lentamente 1,4 mL de FITC dissolvido em DMSO à partícula concentrada funcionalizada com amina. A razão molar de FITC:partícula é de 20:1. Depois disso, incubar a solução a 4 °C durante 8 h no escuro.
- Atenue a reação adicionando o excesso de NH3. H2O (a concentração final de NH3. H2O é 50 mM), deixando a solução ficar a 4 °C no escuro por 2 h. Lave o excesso de FITC usando tampão Na2CO3/NaHCO3 (pH 9) através de um filtro de 10 kDa a 5752 x g a 25 °C por 10 min. O pH final da solução é ajustado para 7,4 usando solução aquosa de HCl.
5. 2P-IVM
NOTA: Para as sessões de 2P-IVM foi utilizado um microscópio Prairie Ultima IV com estágio personalizado (Figura 2 e Supplemental Coding File 1) que permite ajustar a posição da janela craniana horizontal e verticalmente. O software Fiji foi utilizado para pós-processamento e análise das imagens. Dessa forma, o feixe de laser pode ser ajustado para atingir o vidro em um ângulo de 90°, reduzindo artefatos e melhorando a qualidade da imagem.
- Sessão de aquisição de imagens
- Ligue o laser Ti-Safira. Ligue o interruptor do sistema principal e o software Prairie View.
- Anestesiar o animal, conforme descrito acima (passo 2.2). Realizar sessões de imagem por até 2 h por animal. Reduzir o tempo mínimo de aquisição de imagens para reduzir o risco de complicações anestésicas e a morbidade ou mortalidade associadas.
- Imobilizar o camundongo sob o microscópio de dois fótons usando um estágio personalizado (Figura 1B, coluna da direita). Coloque o animal em decúbito ventral em uma almofada aquecida projetada para cirurgia de roedores e prenda-o levemente usando fita adesiva, prestando atenção para não contrair o tórax. Coloque uma gota de água na janela craniana e ajuste o foco.
- Adquira frequência cardíaca e oxigenação sanguínea para monitorar os parâmetros vitais dos animais. Posicione o sensor na pata traseira e mantenha o dispositivo de monitoramento fora da câmara de imagem de dois fótons.
- Uma vez que o animal está no estágio do microscópio, ajuste a posição da cabeça. Usando o binóculo e a iluminação fluorescente de campo largo, ajuste o filtro de proteína fluorescente vermelha (RFP) e encontre o campo de visão de imagem desejado (Figura 1B, coluna da direita).
- Uma vez que a orientação da amostra e o campo de visão são determinados, mude o microscópio do modo de campo largo para o modo de microscopia de varredura de luz (LSM).
- Certifique-se de que o laser Ti-Sapphire está bloqueado em modo a 920 nm, e todas as persianas estão abertas. Leve os detectores de tubo fotomultiplicadores GaAsP (PMT) tensões até 500-600 V. Use dois PMTs com conjuntos de filtros com passagens de banda em 595/50 (RFP) e 525/50.
- Pressione Live Image e modifique lentamente a célula do pockel para aumentar a potência do laser na amostra até que uma imagem seja visível.
- Uma vez que uma imagem clara é alcançada, use o software e o estágio motorizado para definir a parte superior e inferior de uma pilha de imagens dentro da área de amostra desejada. Cuidado com o tamanho do passo e leve em consideração que o eixo Z ajusta a profundidade da lente.
- Com o aumento da profundidade, as imagens ficarão mais escuras. Aumente o ganho de pockels/PMT lentamente para manter a imagem brilhante. Tenha cuidado para não usar muita energia, pois pode levar à fototoxicidade e danos teciduais.
- Defina um caminho de salvamento e inicie a série Z. Ele irá atravessar automaticamente para as posições inicial e final usando as configurações definidas pockel/PMT. Quando a pilha estiver concluída, use a reprodução para examinar a qualidade da pilha. Assim que a aquisição das imagens necessárias estiver concluída, desligue o laser Ti-Safira.
- Mover o animal para uma gaiola de recuperação, conforme descrito acima (passo 3.1).
- Saia da vista Prairie e certifique-se de que todos os dados são salvos/transferidos. Desligue o computador e desligue todo o hardware.
- Pós-processamento com FIJI
NOTA: Fiji é um software de código aberto focado em análise de imagens biológicas21.- Baixe FIJI com relação ao sistema operacional. Descompacte o conteúdo da pasta e execute o arquivo .exe.
- Arraste o arquivo .env coletado da imagem de dois fótons para a caixa de diálogo. Divida os canais em diferentes caixas de imagem. Isso criará duas imagens diferentes com canais diferentes, uma contendo o sinal da célula e a outra o sinal da partícula.
- Copie uma das imagens e clique em Arquivo > Nova Área de Transferência Interna > para criar outra imagem. Renomeie uma das imagens como Source e a outra como Copy.
- Use a imagem de cópia e clique em Processar > Melhorar contraste na caixa de diálogo. Clique em Normalizar e OK e, em seguida, em Processar > Suave. Esta imagem é usada para criar uma máscara e não para análise. Clique em Imagem > Ajustar > Limite na caixa de diálogo. Use a escala deslizante e o método apropriado para extrair e clique em Aplicar.
- Use Process > Binary > Erode para erodir pixels únicos em segundo plano e clique em Process > Binary > Dilate para adicionar pixels de volta à imagem.
- Clique em Process > Image Calculator na caixa de diálogo, selecione a imagem de origem como a primeira e selecione a segunda imagem como Copy. Use AND para criar a interseção de ambas as imagens. Repita a mesma etapa para a imagem do outro canal.
- Para análise do sinal fora da região vascular, abra uma imagem copiada inalterada e exclua a área vascular do sinal com a ferramenta Freehand ROI.
- Defina os parâmetros desejados indo para Analisar > Definir medidas. Verifique se a Área, a Densidade Integrada e o Valor Cinza Médio estão marcados.
- Agora analise por Analisar > Medida. Uma janela com as medidas aparecerá. Copie os dados em uma planilha.
- Agora selecione uma pequena área da imagem que não tenha fluorescência. Este será o pano de fundo.
- Clique em Analisar > Medida para essa região. Copiar dados para uma planilha.
- Salve a imagem resultante como Arquivo > Salvar como > Analisar tipo de arquivo para fins de remedições ou publicação.
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Representative Results
Aqui, realizamos cirurgia de janela craniana e enxertamos células C6 em um modelo de GBM em camundongos NSG (n = 5). Uma vedação adequada entre todos os componentes envolvidos na criação da janela (Figura 1A) garantirá a durabilidade das janelas para obtenção de imagens a longo prazo e, adicionalmente, reduzirá a morbidade. Usando o estágio adaptado para 2P-IVM in vivo (Figura 2), pudemos obter imagens de animais sob anestesia por até 2 h sem grandes artefatos de movimento. Aproximadamente 10 min após a aplicação intravenosa das nanopartículas em camundongos portadores de GBM, o 2P-IVM mostra o sinal verde e fluorescente dos vasos na região do tumor, consistente com a localização intravascular das nanopartículas marcadas com FITC. Apenas uma pequena quantidade de sinal verde-fluorescente é notada fora dos vasos sanguíneos, indicando o extravasamento inicial de DNs (Figura 3A). Observa-se aumento do sinal da FITC proveniente do espaço extravascular, o que está de acordo com o extravasamento avançado (Figura 3B).
Gráfico 1. Colocação de janela craniana, craniotomia, implante e exames de imagem. (A) Secção transversal do posicionamento anatômico de uma janela craniana. Como a barra principal é livre de metal, é possível realizar imagens por ressonância magnética ou imagens por partículas magnéticas, além da microscopia intravital de dois fótons. (B) Visão geral (fileira superior) e visão detalhada (fileira inferior) da craniotomia (esquerda), implantação celular (média) e microscopia intravital de 2 fótons (direita). Ao abrir o crânio, ocorre sangramento superficial (esquerdo) e é rapidamente reabsorvido (médio). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Projeto assistido por computador (CAD) do estágio. CAD do estágio usado para microscopia intravital in vivo de 2 fótons, incluindo barra de mordida, estabilização da barra cefálica e parafusos para ajustes de altura e ângulo. O arquivo CAD 3D pode ser encontrado em Supplemental Coding File 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Imagens in vivo de microscopia intravital de 2 fótons. Imagens adquiridas (A) 10 min e (B) 24 h após a administração intravenosa de nanopartículas. Enquanto as células GBM emitem sinais fluorescentes no espectro vermelho (esquerda), as nanopartículas no tecido cerebral são visualizadas em verde (direita). # indica NPs extravasadas, * indica um vaso sanguíneo. Apenas um número limitado de partículas sofreu extravasamento e são visíveis nas proximidades das células tumorais 10 minutos após a administração de NP. Uma abundância de partículas é visível na região das células GBM, sugerindo extravasamento 24 h após a administração de NP. As nanopartículas consistem em isotiocianato de fluoresceína (FITC) e nanopartículas de óxido de ferro (Ferumoxytol). As barras de escala representam 100 μm. Abreviações: 2P-IVM: microscopia intravital de 2 fótons, RFP: proteína fluorescente vermelha, GBM: glioblastoma, FITC: isotiocianato de fluoresceína, NP: nanopartículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo de codificação suplementar 1: arquivo CAD 3D do estágio. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Apresentamos um método para rastreamento in vivo de NP em tempo real usando 2P-IVM através de uma janela craniana para avaliar a liberação tumoral de NPs de óxido de ferro marcadas com fluorescência. A técnica cirúrgica para este procedimento requer mão firme e habilidades cirúrgicas experimentais avançadas. É aconselhável praticar o uso de carcaças ou objetos simuladores antes de avançar para a experiência com animais vivos. Como alternativa, Hoeferlin e col. implementaram uma broca robótica para reduzir o dano térmico, minimizar a variabilidade da técnica cirúrgica e padronizar a cirurgia22.
O tamanho da janela representa outro parâmetro crítico. Uma janela maior permitiria a obtenção de imagens de uma porção maior do tumor com 2P-IVM. Na literatura, tamanhos entre 3-7 mm têm sido descritos23. No entanto, janelas maiores não podem acomodar a curvatura cerebral, o que pode levar ao aumento da pressão regional24. Para superar essa restrição, pode-se usar o chamado "crânio de vidro"25. Em comparação com as janelas de vidro tradicionais, este método usa vidro curvo, acomodando a curvatura do cérebro e, assim, permitindo a criação de janelas maiores, reduzindo a pressão focal no córtex. Este tipo de vidro curvo não está disponível comercialmente, e tem aplicações limitadas em 2P-IVM, uma vez que a superfície curva causa artefatos de reflexão, limitando a área da janela que poderia ser fotografada. Outra alternativa é uma janela à base de silício24. Por um lado, esse método oferece mais flexibilidade em relação ao tamanho e à forma da janela a ser criada. Além disso, resultados comparáveis em termos de falhas de janelas e taxas de inflamação às janelas de vidro clássicas foram relatados. Por outro lado, a qualidade da imagem de 2 fótons em janelas baseadas em polímeros diminuiu mais rapidamente do que em janelas de vidro, tornando-a inviável para aplicações de longo prazo26. Uma janela craniana de crânio afinada representa outra alternativa. Embora seja menos invasiva do que a janela de vidro clássica, não permite a implantação de células GBM usando a mesma técnica descrita aqui. Além disso, é difícil obter uma espessura craniana consistente e, como resultado, isso pode causar artefatos significativos na 2P-IVM27.
A linhagem celular e a quantidade de células GBM que estão sendo implantadas são outras considerações importantes no planejamento do cronograma do estudo. A linhagem celular de glioma de rato C6 é uma das linhagens celulares mais utilizadas na pesquisa do GBM. Em ratos e camundongos, números celulares entre 5 x 10,4 e 5 x 10,6 têm sido relatados para implantes intracranianos27,28,29,30,31. Como regra geral, ao implantar um número maior de células, o crescimento mais rápido do tumor é esperado. Neste protocolo, 1 x 105 células foram implantadas e imagens foram realizadas nos dias 11 e 12 após o implante. implantaram 1 x 105 células C6 em camundongos BALB/c nude e relataram a detecção de GBM avançado na RM no 7º dia pós-implantação e aumento da mortalidade após 15 dias30. Em comparação, Jia e col. utilizaram um número maior de células (1 x 106) e a mesma cepa de camundongo e detectaram uma pequena massa tumoral no 7º dia na RM com uma barreira hematoencefálica (BHE) levemente rompida, como demonstrado por uma coloração pálida de azul de Evans no tecido GBM32. No dia 14, a mancha azul de Evans foi mais forte do que no dia 7, indicando que o BBB foi altamente interrompido. Por sua vez, o crescimento do tumor também afeta por quanto tempo os animais podem ser mantidos no experimento. Esta é uma importante consideração do bem-estar animal para estudos longitudinais de imagem. As janelas cranianas crônicas têm sido relatadas como adequadas para exames de imagem por até 6 meses após o implante26.
As nanopartículas utilizadas neste protocolo consistem de componentes de óxido de ferro e fluoróforo. Possíveis aplicações incluem a investigação da liberação tumoral de novas drogas terapêuticas, terapêutica celular e intervenções na vasculatura tumoral e no microambiente tumoral. Diferentes candidatos a drogas e terapias combinadas podem ser avaliadas em nível celular e molecular. O componente óxido de ferro dos NPs permite imagens multimodais com ressonância magnética ou ressonância magnética, além de 2P-IVM. Embora a RM represente uma modalidade de imagem clinicamente relevante, sua resolução anatômica é inferior à da microscopia intravital33.
Este método também tem certas limitações. As coordenadas cerebrais de acordo com um atlas cerebral de camundongos são padronizadas para camundongos C57BL/6J e devem ser ajustadas dependendo da cepa, sexo e idade do camundongo. Além disso, com imagens de dois fótons, apenas uma profundidade limitada de aproximadamente 450 μm pode ser acessada9. Portanto, apenas a caracterização parcial do tumor é possível com o 2P-IVM, e diferenças regionais nas características do tumor poderiam ser perdidas. Além disso, apenas dois momentos após a administração do PE foram incluídos. Estudos futuros, incluindo maior tempo após a administração intravenosa, permitirão uma análise mais detalhada do comportamento espaço-temporal dos PNs no microambiente tumoral.
Para concluir, avaliamos a liberação tumoral de nanopartículas fluorescentes de óxido de ferro usando 2P-IVM em um modelo de GBM em camundongos. Este método pode ser facilmente modificado para se adequar a várias áreas de pesquisa e representa uma importante ferramenta para imagens cerebrais in vivo no campo da neurociência.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, ao Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging (SCi3) - centro de imagens de pequenos animais, ao NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) e ao Stanford Preclinical Imaging Facility at Porter Drive por fornecer o equipamento e a infraestrutura para este projeto. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional de Saúde da Criança e Desenvolvimento Humano, bolsa número R01HD103638. Agradecemos ao Grupo Schnitzer, Universidade de Stanford; o laboratório Zuo, da Universidade de Santa Cruz; e o Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, University of Boston, para discussões educacionais sobre imagens de dois fótons e modelos de janela craniana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Invitrogen | 11965-092 | |
| 1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
| 10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
| 10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| 2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
| Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
| Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
| Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
| Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
| Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
| Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
| Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
| Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
| Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
| Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
| Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
| Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
| Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
| Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
| Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
| Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
| FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
| Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
| Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
| Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
| Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
| Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
| Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
| Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
| HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
| Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
| Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
| Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
| Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
| Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
| Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
| Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
| Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
| Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
| Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
| Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
| Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
| Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
| Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
| Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
| Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
| Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
| Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
| Styrofoam box | N/A | N/A | |
| Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
| Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
| Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
| TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
| Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
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