Summary
Protokollen presentert i denne studien illustrerer effektiviteten til cAMP Difference Detector In Situ for å måle cAMP gjennom to metoder. En metode bruker et 96-brønns plateavlesningsspektrofotometer med HEK-293-celler. Den andre metoden demonstrerer individuelle HASM-celler under et fluorescerende mikroskop.
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) er en ny biosensor som muliggjør kontinuerlig måling av cAMP-nivåer i levende celler. Biosensoren er laget av et sirkulært permutert fluorescerende protein knyttet til hengselområdet til Epac2. Dette skaper en enkelt fluoroforbiosensor som viser enten økt eller redusert fluorescens ved binding av cAMP. Biosensoren finnes i røde og grønne oppadgående versjoner, samt grønne nedadgående versjoner, og flere røde og grønne versjoner rettet mot subcellulære steder. For å illustrere effektiviteten til biosensoren ble den grønne nedadgående versjonen, som avtar i fluorescens ved cAMP-binding, brukt. To protokoller som bruker denne sensoren er demonstrert: en som bruker et 96-brønns plateavlesningsspektrofotometer som er kompatibelt med screening med høy gjennomstrømning og en annen som bruker encellet avbildning på et fluorescerende mikroskop. På plateleseren ble HEK-293-celler dyrket i 96-brønns plater stimulert med 10 μM forskolin eller 10 nM isoproterenol, noe som induserte raske og store reduksjoner i fluorescens i den grønne nedadgående versjonen. Biosensoren ble brukt til å måle cAMP-nivåer i individuelle humane luftveisglatte muskulatur (HASM) celler overvåket under et fluorescerende mikroskop. Den grønne nedadgående biosensoren viste lignende responser på populasjoner av celler når den ble stimulert med forskolin eller isoproterenol. Denne encellede analysen tillater visualisering av biosensorplasseringen ved 20x og 40x forstørrelse. Dermed er denne cAMP-biosensoren følsom og fleksibel, og tillater sanntidsmåling av cAMP i både udødeliggjorte og primære celler, og med enkeltceller eller populasjoner av celler. Disse egenskapene gjør cADDer et verdifullt verktøy for å studere cAMP-signaldynamikk i levende celler.
Introduction
Adenosin 3′,5′-syklisk monofosfat, cAMP, spiller en sentral rolle i cellulær kommunikasjon og koordinering av ulike fysiologiske prosesser. cAMP fungerer som en andre budbringer, og videresender eksterne signaler fra hormoner, nevrotransmittere eller andre ekstracellulære molekyler for å starte en kaskade av intracellulære hendelser1. Dessuten er cAMP intrikat involvert i ulike signalveier, inkludert de som er assosiert med G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) og adenylylsyklaser. Å forstå rollen til cAMP i cellulær signalering er grunnleggende for å avdekke de komplekse mekanismene som ligger til grunn for normale cellulære funksjoner og utviklingen av potensielle terapier for et bredt spekter av medisinske tilstander2.
Tidligere har ulike metoder blitt brukt for å måle cAMP direkte eller indirekte. Disse inkluderte radiomerking av cellulære ATP-bassenger etterfulgt av kolonnerensing, HPLC, radioimmunanalyser og enzymkoblede immunanalyser 1,2. Disse eldre analysene er begrenset av det faktum at de er endepunktsmål, som krever et stort antall prøver for å konstruere tidsavhengige responser. Nylig ble Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)-sensorer utviklet for å lage analyser i levende celler, produsere sanntids, dynamiske data og tillate sensorer å målrettes på forskjellige subcellulære steder3. FRET utnytter to fluoroforer, en fluorescerende donor og en fluorescerende akseptor som når den er i umiddelbar nærhet, vil akseptorfluoroforen bli begeistret av donorens fluorescerende utgang. De to mest brukte fluoroforene er cyanfluorescerende protein (CFP) og gult fluorescerende protein (YFP) siden disse har kompatible eksitasjons- og emisjonsegenskaper. I tillegg til CFP og YFP, brukes bruken av det grønne fluorescerende proteinet (GFP) og det røde fluorescerende proteinet (RFP) ofte for FRET-biosensorer. cAMP FRET-biosensorer fungerer ved å ha en donor og akseptor på motsatte ender av Epac2 cAMP-bindingsproteinet. cAMP-binding endrer bekreftelsen av Epac og øker avstanden mellom donor- og akseptorfluoroforer 3,4. Denne konformasjonsendringen oppdages ved tap av FRET, det vil si eksitasjon av akseptorfluoroforen ved energi overført fra donorfluorofordråpene3. Selv om det er en tilsynelatende enkel prosess, er det en overflod av begrensninger og problemer med FRET-biosensoren for cAMP-forskning5. En av dem er valg av fluorescerende proteiner, for eksempel GFP, som kan dimerisere naturlig, og dermed redusere følsomheten6. FRET-baserte cAMP-biosensorer har vært målrettet mot spesifikke mikrodomener7, men det kan være begrensninger på grunn av den store størrelsen på en konstruksjon med to fluoroforer6. Et annet viktig problem er det lave signal-til-støy-forholdet til FRET-signaler som følge av overlappingen mellom eksitasjon og emisjon av fluoroforen, noe som resulterer i høy prøvetakingsfrekvens og kompliserer analysen av resultatene 4,5.
Senest har den nye biosensoren (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis løst disse og andre begrensninger når det gjelder å studere reguleringen av cAMP-signalering8. En viktig forbedring er avhengigheten av en enkelt fluorofor. Dette gir et raskt og effektivt signal med et bredere dynamisk område og et høyt signal-til-støy-forhold. Som et resultat kan det være mer nøyaktighet ettersom det er et mindre bredt spekter av bølgelengder å gre gjennom8. I likhet med FRET-prober har biosensoren blitt rettet mot subcellulære steder, noe som tillater forskning på kompartmentteorien og utforskning i lipidflåter og ikke-flåter, og andre subcellulære domener9. Kanskje viktigst er egnetheten til en enkelt fluoroforbiosensor for screening med høy gjennomstrømning, som har forbedret følsomhet og reproduserbarhet i forhold til FRET-baserte biosensorer. Biosensoren er pakket inn i en BacMam-vektor for enkel transduksjon av et bredt spekter av celletyper og presis kontroll over proteinuttrykk.
Ekspresjonskontroll via BacMam-vektoren kan være spesielt nyttig i analyser ved bruk av GPCR-ortologer fra forskjellige arter for å lette tolkningen av data fra dyrestudier. Videre er kontroll over reseptorekspresjon avgjørende for å måle de forskjellige gradene av legemiddeleffekt (f.eks. inverse agonister og partielle agonister), og lave nivåer av reseptorekspresjon er nyttige for å etterligne de lave nivåene som finnes i dyrevev. BacMam er en baculovirusvektor som har blitt modifisert for å transdusere pattedyrceller som primære cellekulturer og HEK-293-linjer10. Dominerende selekterbare markører gjør det mulig for BacMam å gi mer stabilitet i forhold til tradisjonelle plasmidinfeksjoner11. Slike selektive promotorer muliggjør mer effektiv genlevering og uttrykk. I tillegg øker tilsetning av trichostatin A (en histondeacetylasehemmer) reporterproteinnivåene11. Ekspresjonsnivåer kan kontrolleres via titeren til BacMam-viruset som brukes og bør optimaliseres for hver celletype. Når det gjelder denne biosensoren, er et rødt eller grønt fluorescerende protein knyttet til Epac ved N- og C-terminalene. Når cAMP binder seg, flytter en konformasjonsendring i biosensoren aminosyrer ved siden av det fluorescerende proteinet. Et slikt skifte flytter absorbansen fra den anioniske tilstanden til den nøytrale tilstanden ved 400 nm, og reduserer dermed fluorescensen.
Det er 90-120 GPCR-er uttrykt i en enkelt celle som reagerer på et bredt spekter av nevrohumorale signaler12. Derfor kan det antas at minst flere dusin GPCR-er per celle kan stimulere eller hemme cAMP gjennom henholdsvis Gs- eller Gi-kobling. Selv om det har vært fremgang i å overvåke denne andre budbringeren i sanntid, for eksempel FRET, er det behov for mer effektive metoder. Metodikken for å overvåke syntese og degradering av cAMP-signaler ved bruk av cADDis i sanntid presenteres her. Endringen i fluorescens kan overvåkes i sanntid ved hjelp av en fluorescensplateleser for analyser med høy gjennomstrømning eller ved hjelp av et fluorescerende mikroskop for encelleanalyser. Disse metodene er nyttige for et bredt spekter av biologiske spørsmål angående GPCR-signalering via cAMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detaljene om alle reagensene og utstyret som ble brukt til studien er oppført i materialtabellen.
1. Plateavlesningsspektrofotometer med høy gjennomstrømningsanalyse
- Såing av HEK-293-celler med cADDis BacMam-vektoren i en 96-brønns plate (dag 1)
- Del og infiser celler i en viral hette.
- Varme HEK-medier (tabell 1) og 0,25 % trypsin-EDTA i et 37 °C vannbad.
- Desinfiser hetten og materialene ved å tørke av dem med EtOH-gjennomvåt serviett.
- Fjern og kast HEK-medier fra kolben med en serologisk pipette.
- Tilsett 5 ml Mg2+ og Ca2+ fri DPBS (37 °C) med en serologisk pipette. Vipp kolben frem og tilbake for å vaske bunnen med DPBS. Fjern og kast DPBS med en serologisk pipette.
- Trypsiniser cellene ved å tilsette 3 ml oppvarmet 0,25% trypsin-EDTA med en serologisk pipette. Vipp kolben for å sikre at reagenset dekker bunnen av kolben helt. Sett lokket på kolben og la reagenset sitte i 3-5 minutter for å la cellene løsne fra kolben.
MERK: Dette eksperimentet er optimalisert for en 75 cm2 kolbe; Volumjusteringer for reagenser må kanskje gjøres hvis et kulturapparat av annen størrelse brukes. - Trekk 5 ml ferske medier som inneholder antibiotika. Fjern og trekk volumet av kolben for å vaske veggene på kolben og fysisk løsne celler.
- Samle det totale volumet av kolben (8 ml), og sentrifuger (25 °C) i et 15 ml rør ved 200 x g i 5 minutter.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten med en serologisk pipette, forsiktig så du ikke forstyrrer pelleten.
- For å vaske cellene uten å forstyrre pelleten, tilsett 500 μL DPBS uten Mg2+ og Ca2+ DPBS på siden av 15 ml røret. Etter å ha tilsatt DPBS forsiktig, fjern og kast så mye buffer som mulig uten å forstyrre pelleten. Gjenta en gang til.
- Tell cellene og juster til en celletetthet på 250 000 celler/ml celler.
- Lag en masterblanding basert på hvilke reagensvolumer som trengs per brønn på en svart, gjennomsiktig bunnplate med 96 brønner. Dette blir referert til som "vevsplaten". Se bind nedenfor:
MERK: Eksempel på 1 brønn (totalt volum 200 μL): 40 μL av biosensoren BacMam-vektor (lager av 2 x 1010 virale gener /ml), 2 μL trichostatin A (lager på 100 μM; sluttkonsentrasjon 1 μM), 158 μL av 250 000 celler/ml celletetthet. Eksempel på 10 brønner (totalt volum 2 ml): 400 μL av biosensoren BacMam-vektor (lager av 2 x 1010 virale gener /ml), 20 μL trichostatin A (lager på 100 μM), 1,580 μL media med 250,000 celler/ml celletetthet. - Tilsett 200 μL masterblanding per brønn. Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i en inkubator i 24 timer før de kjøres på plateavlesningsspektrofotometeret.
- Del og infiser celler i en viral hette.
- Kjører på plateleser
- Fjern forsiktig alle medier i hver brønn på en benkeplate og erstatt med 180 μL DPBS med Mg2+ og Ca2+ ved 37 °C.
- Inspiser celler på et mikroskop for å bekrefte cellehelsen.
- Pakk platen inn i aluminiumsfolie og inkuber ved 37 °C i 30 min-1 t.
- Mens du inkuberer, forbered medisinene for avlesningen ved 1:10 fortynning (også kalt 10 ganger) for ønsket sluttdose. Forbered derfor 100 μM forskolin og 100 nM isoproterenol.
- Tilsett 60 μL av hvert legemiddel på en søyleformet måte til en klar 96-brønns plate (referert til som "medikamentplaten").
MERK: Med riktig medikamentfortynning og for å optimalisere avlesningen, tilsettes legemidlene til en klar 96-brønns plate, referert til som "medikamentplaten", som skal overføres på tidspunktet for avlesningen til "vevsplaten" ved hjelp av en 96-multi pipettor, slik at legemidlet kan tilsettes alle brønner samtidig og raskt leses av det fluorescerende spektrofotometeret.
- Oppsett av fluorescensplateleser
- Juster innstillingene til fluorescensplateleseren.
- Lesemodus: fluorescens. Les Type: kinetisk. Avlesning av bølgelengder: 494 nm og 522 nm.
- Lesetid: Angi 3 minutter for baseline fluorescerende avlesning og 7 minutter for tilsetning etter medikament." Intervall" legges inn som 00:00:30 i 30 s mellom hver lesing.
NOTAT: Lesetiden kan optimaliseres og økes basert på ønsket tid.
- Juster innstillingene til fluorescensplateleseren.
- Datainnsamling
- Fjern vevsplaten fra inkubatoren, fjern aluminiumsfolien og platelokket, og plasser vevsplaten i plateleseren. Lukk leserskuffen for å la vevsplaten hvile og komme i likevekt til leserens temperatur (37 °C).
- Plasser den klare 96-brønnsplaten (medikamentplaten) med medikamentfortynningene under 96-multipipetten og øv deg på å trekke 20 μL fra brønnene. Sørg for at det trekkes et jevnt volum medikament i pipettespissene.
- Start en "baseline"-målingskjøring.
MERK: 40 RFU eller høyere anses som levedyktige data. Hvis dataene er under denne verdien, bør eksperimentet stoppes og forkastes. - Vevsplaten vil skytes ut fra leseren på slutten av baseline-kjøringen. Tilsett raskt og forsiktig 20 μL fra den klare legemiddelplaten til den svarte vevsplaten. Deretter begynner du raskt "behandlings"-løpet. Vevsplaten skal ikke være ute av leseren i mer enn 30 sekunder etter at medisiner er tilsatt.
NOTAT: Hvis stoffet tilsettes for raskt, løsner cellene fra vevsplaten, og skaper et ubrukelig eksperiment. I tillegg er cellene infisert med et lysfølsomt grønt fluorescerende protein; Derfor er det viktig å raskt og raskt legge til medisinene og begynne den andre lesingen for å unngå å gå glipp av den tidlige delen av responsen. - Når den andre avlesningen er fullført, sørg for at vevsplaten er kastet ut av leseren og datainnsamlingen er avsluttet.
NOTAT: Før du kaster vevsplaten, er det beste praksis å verifisere at cellene fortsatt er festet til platen. Observer cellene under et mikroskop. Hvis cellene løsner, er resultatene ugyldige og bør kastes. Eksperimentet må gjentas. - Eksporter de resulterende dataene som en Excel-fil.
- Åpne de eksporterte Excel-lesbare dataene fra plateleseren og kopier og lim inn relevant informasjon i Excel-konverteringsmalen. Dataene vil transformeres fra plateleseroppsettet til enkeltbrønn, kolonneavlesninger til høyre for de kopierte dataene.
MERK: Kolonner med fluorescens for en brønn over tid er oppført på RFUer (tittel kolonnetransformasjon) og som en desimalendring i forhold til RFU-avlesningen ved første avlesning (t0 med tittelen Delta F). I Excel-malen er Delta F-tabellen satt til siste grunnlinjeavlesning før legemiddeladdisjon. Dette er det 6. - Etter datatransformasjon, kopier dataene fra Delta F og lim dem inn i dataanalyseprogramvare som forfall eller relativt forfall i fluorescens over tid.
- Endre X-tittelen til "tid (s)" og Y-tittelen til "ΔF/F0" for relative desimalverdier.
2. Encellet analyse ved bruk av et omvendt fluorescerende mikroskop
- Såing (HASM) celler med cADDis BacMam-vektoren i en 35 mm tallerken (dag 1)
- Del og infiser celler i en viral hette.
- Varme HASM-medier (tabell 1), 0,25 % trypsin-EDTA i et 37 °C vannbad.
- Desinfiser hetten og materialene og tørk av hetten med EtOH-gjennomvåt serviett.
- Fjern og kast HASM-medier fra kolben med en serologisk pipette.
- Tilsett 5 ml Mg2+ og Ca2+ fri DPBS (37 °C) med en ny serologisk pipette og vipp kolben for å vaske bunnen med DPBS.
- Trypsiniser celler ved å tilsette 3 ml oppvarmet 0,25% trypsin-EDTA med en serologisk pipette. Vipp kolben for å sikre at reagenset dekker bunnen av kolben helt. La reagenset sitte i 3-5 minutter for å la cellene løsne fra kolben.
- Trekk 5 ml ferske medier som inneholder antibiotika og fjern pipetten for å fjerne cellene fra bunnen av kolben.
- Samle det totale volumet av kolbens (8 ml) sentrifuge i et sentrifugerør ved 200 x g i 5 minutter.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten med en serologisk pipette, forsiktig så du ikke forstyrrer pelleten.
- Uten å forstyrre pelleten, tilsett 500 μL DPBS uten Mg2+ og Ca2+ DPBS på siden av sentrifugerøret. Fjern og kast så mye væske som mulig og gjenta en gang til.
MERK: Dette eksperimentet er optimalisert for en 75 cm2 kolbe; Volumjusteringer for reagenser må kanskje gjøres hvis et kulturapparat av annen størrelse brukes. - Tell celler og juster til 40 000 celler/ml celletetthet.
- Lag en masterblanding basert på reagensvolumet som trengs per brønn i en 35 mm tallerken. Se bind nedenfor:
MERK: Eksempel på 1 brønn (totalt volum 500 μL): 20 μL av biosensoren BacMam-vektor (lager av 2 x 1010 virale gener/ml), 5 μL trichostatin A (lager på 100 μM, sluttkonsentrasjon 1 μM), 500 μL med 40 000 celler/ml celletetthet. Eksempel for 4 brønner (totalt volum 2 ml): 80 μL av biosensoren BacMam-vektor (lager av virale gener /ml), 20 μL trichostatin A (lager på 100 μM, sluttkonsentrasjon 1 μM), 2000 μL media 40 000 celler/ml celletetthet. - Tilsett 500 μL masterblanding per brønn. Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer før du fortsetter eksperimentet.
MERK: Cellenummeret kan variere i henhold til cellelinjen. Hvis du vil unngå overlappende celler for analysen, kan du bruke lave celletall.
- Del og infiser celler i en viral hette.
- Klargjøring av farmakologiske midler (dag 2)
- Fjern mediet forsiktig i hver brønn og erstatt med 450 μL DPBS med Mg2+ og Ca2+ ved 37 °C.
- Pakk platen inn i aluminiumsfolie og inkuber 35 mm skiven ved 37 °C i 30 min-1 t.
- Inspiser celler på et mikroskop for å bekrefte cellehelsen.
- I mellomtiden forbereder du legemidlene for avlesning 1 logenhet over ønsket sluttkonsentrasjon (10 ganger større). Forbered derfor 100 μM forskolin og 100 nM isoproterenol.
- For log-dosetitere, klargjør legemidlet ved 10 mM og bruk seriefortynninger for å oppnå 100 μM forskolin og 100 nM isoproterenol.
- Datainnsamling
NOTAT: Følgende innstillinger er for et fluorescerende invertert mikroskop. Programvaren som følger med hvert mikroskop kan variere; De generelle innstillingene som brukes i gjeldende protokoll er beskrevet her.- Slå på det sentrale navet, deretter det omvendte fluorescerende mikroskopet.
- Åpne programvaren som skal brukes til opptaket og velg alternativet for time-lapse-opptak .
- Plasser en 35 mm fatprøveholder i mikroskoptrinnet.
- Sett objektivlinsen til x20.
- Bruk autofokus og få et så klart bilde som mulig. Hvis det er vanskelig å finne individuelle celler, start på et 4x mål, og gå deretter til 20x. Fokuser prøven manuelt hvis mikroskopet mangler en autofokusfunksjon.
MERK: Forstørrelsen på 40x kan brukes hvis det er behov for mer signifikante cellemorfologiske detaljer. - Juster følgende innstillinger for å oppnå optimal datainnsamling: Automatisk lysstyrke (eksponering), Magnetiseringsbølgelengde, Svartbalanse (for å redusere bakgrunnsstøy), Autofokus.
- Etter å ha funnet et synsfelt med flere cytoplasmatiske fluorescerende celler, innhent data ved hjelp av time-lapse-fangst i 20 minutter hver 30.
- Klikk på go for å starte lesingen.
- Løp i 3 minutter for å samle baseline. Så snart 3 minutters fangst er tatt, tilsett forsiktig 50 μL av stoffet til riktig brønn. Når legemidlene tilsettes, vil den endelige konsentrasjonen på parabolen være 10 μM forskolin og 10 nM isoproterenol.
MERK: Legemidlet må tilsettes forsiktig; Ikke berør platen med pipettespissen, da dette kan flytte feltet av view laget og gjør prøven ute av stand til å analyseres. - La eksperimentet kjøre i 17 minutter til med datafangst hvert 30.
- Når testen er fullført, sørg for at dataene er klare for analyse.
MERK: Selv om den nåværende protokollen ikke inneholder en kontroll for fokaldrift, kan det være fordelaktig å inkludere en i eksperimentet. For eksempel kan bruk av kjernefysiske fargestoffer hjelpe til med å håndtere fokaldrift under mikroskopanalyse, spesielt når du tar bilder av levende celler over lengre varighet. cADDis biosensorer er vanligvis distribuert bredt i cellen, noe som gjør et bredt fokalplan til den mest effektive fangsten og reduserer behovet for å kontrollere fokaldrift9.
- Analysere dataene
MERK: Programvaren som følger med hvert mikroskop kan variere, så de generelle innstillingene som skal brukes til å analysere bildene er beskrevet her.- Åpne bildefilene som ble tatt under eksperimentet.
- Bruk polygon - eller sirkelverktøyet til å velge interesseområdet for hver celle for å utføre analysen. Analysen skal gi lysstyrken til hver celle på hvert tidspunkt.
MERK: Beste praksis er å velge individuelle celler og ikke celler som berører veggen på parabolen eller andre celler. Dette sikrer best mulig datainnsamling. Velg minst 5 celler for analyse innenfor hver betingelse, og repliker eksperimentet minst tre ganger. - Etter å ha analysert dataene, åpner du dataene i et Excel-ark og beregner gjennomsnittlig lysstyrke for hver tilstand ved hvert bilde, og starter på bildet rett før du legger til de farmakologiske midlene eller kjøretøyet. I dette eksemplet, ved 3 min-merket eller det6 bildet tatt med mikroskopet, siden hvert bilde er tatt hvert 30.
- Beregn ΔF/F0 for hver gjennomsnittsverdi i hver tilstand.
- Last inn i en statistisk analyseprogramvare og plott ΔF/F0 mot tiden i s.
MERK: Figur 1 gir en skjematisk oversikt over de viktigste trinnene i protokollene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien validerte den cytosoliske biosensoren i både plateleser- og mikroskopanalyser. Når cellene uttrykte biosensoren, ble de stimulert med enten 10 μM forskolin (en direkte aktivator av adenylylsyklase), 10 nM isoproterenol (en agonist ved ß1AR og ß2AR), eller vehikel (figur 1). De påfølgende endringene i fluorescens, som indikerer cAMP-produksjon, ble fanget opp hvert 30.
Dataene ble transformert som endringen i fluorescens fra den opprinnelige fluorescensen (ΔF/F0). En henfallsmodell på ett sted ble brukt på fluorescensdataene for å kvantifisere de tidsmessige endringene i cAMP-nivåer på tvers av de forskjellige forholdene (figur 2 og figur 3). Parametrene til disse henfallskurvene kan brukes til å kvantifisere responsen på en gitt konsentrasjon av legemidlet. Produktet av henfallshastigheten (k) og platået som en enkelt verdi som kvantifiserer legemiddelresponsen ble brukt, og disse ble brukt til å lage konsentrasjon-responskurver når flere konsentrasjoner av samme medikament brukes13.
På plateleseren, ved stimulering med 10 μM forskolin, viste den cytosoliske sensoren en betydelig reduksjon i fluorescensintensitet i løpet av sekunder og progredierte over mange minutter (fra baseline 0 ΔF/Fo ved 200 s til -0,7 ΔF/Fo ved 600 s) i HEK-293-celler (figur 2A). Gitt den grønne sensorens design, indikerer en reduksjon i fluorescens en økning i cAMP-produksjonen, noe som indikerer at forskolin forårsaket en jevn økning i cAMP-nivåer i cytosolen. Stimulering av HEK-293-celler med en submaksimal konsentrasjon av isoproterenol (10 nM) førte til raske, men mindre reduksjoner i biosensorfluorescensen (-0,3 ΔF/Fo ved 600 s, figur 2A). Når disse lavere konsentrasjonene av isoproterenol (10 nM og 100 nM) ble undersøkt i en enkelt brønn av celler over tid, ble det observert svingninger av cAMP-nivåer i HEK-293-celler (figur 2B). Periodisiteten til disse svingningene var konsekvent rundt 200 s. Den rutinemessige dataanalysen inkluderer tilpasning av responsen til en enkelt henfallsmodell, som gjennomsnitter disse svingningene (se forbindelseslinje). Gjennomsnitt av flere eksperimenter sammen førte vanligvis til at disse svingningene ble skjult i dataene. Ikke desto mindre viser biosensoren en følsomhet og rask kinetikk som gjør det mulig å observere cAMP-svingninger.
cADDis kan også måles ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Denne tilnærmingen tillater overvåking av cAMP i enkeltceller og kan også tilpasses for å visualisere biosensorer som er målrettet mot forskjellige subcellulære steder. I denne studien ble biosensoren brukt i primære humane luftveisglatte muskulatur (HASM) celler. Stimulering av HASM med enten vehikel, 10 μM foskolin eller 10 nM isoproterenol fører til en observerbar reduksjon i fluorescensintensitet over tid (fra baseline 0 ΔF/Fo ved 120 s til -0,9 ΔF/Fo ved 410 s) (figur 3) (Video 1, Video 2 og Video 3). Fluorescens er jevnt fordelt gjennom cytosolen til celler og ekskluderer kjernen (se time-lapse-videoene). Dermed produserte forskolin og isoproterenol en lignende rask og betydelig reduksjon i fluorescens HASM-celler. Disse dataene demonstrerer evnen til å bruke biosensoren i primære cellekulturer.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av biosensorprotokolltrinnene. Til å begynne med blir kulturceller delt og suspendert på nytt med ferske medier, deretter infisert med BacMam-viruset som bærer cADDis-sensorene. Post-transfeksjonsceller stimuleres med farmakologiske midler som utløser cellulære veier som endrer cAMP. Endringer i fluorescensintensiteten som respons på den varierende cAMP-konsentrasjonen fanges opp ved hjelp av et plateavlesningsspektrofotometer (A) eller fluorescensmikroskop (B), noe som gir en sanntidskvantifisering av cAMP-dynamikken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sanntidsovervåking av cAMP i levende HEK-293-celler på et plateavlesningsspektrofotometer. Fluorescens av HEK-293-celler på 96-brønns plater som uttrykker biosensoren ble målt over tid. Etter at baseline-fluorescens ble etablert, ble fluorescenshenfall overvåket i 7 min. (A) Fluorescenshenfall etter tilsetning av enten 10 μM forskolin eller 10 nM isoproterenol er plottet som gjennomsnitt ± SEM av 10-15 eksperimenter. (B) Fluorescenshenfallsoscillasjoner vises ved å plotte et enkelt eksperiment etter tilsetning av enten 10 nM eller 100 nM isoproterenol. Data i begge grafene passer til en enkelt stedshenfallsmodell (forbindelseslinje). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sanntidsovervåking av cAMP i levende HASM-celler på et fluorescensmikroskop. Fluorescens av HASM-celler på belagte 35 mm tallerkener som uttrykker biosensoren ble målt over tid. Etter at baseline-verdier ble etablert, ble fluorescenshenfall målt hvert 30. Det indikerte middelet ble tilsatt ved 120 s (pil). Biosensorens fluorescenshenfallskurver som respons på enten vehikel, 10 μM forskolin eller 10 nM isoproterenol. Data fra et enkelt eksperiment vises med en forbindelseslinje. Time-lapse-videoer av celler behandlet med vehikel (kontroll), forskolin eller isoproterenol er inkludert for å gi en visuell representasjon av de fluorescerende responsene til biosensoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Time-lapse-video av sanntidsovervåking av cAMP i live HASM-celler som respons på kjøretøyet. Fluorescenshenfallskurver for biosensoren som respons på kjøretøyet (kontroll). Hvert bilde ble tatt hvert 30 sekund i 20 minutter. Målestokk: 40 μM. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Time-lapse-video av sanntidsovervåking av cAMP i live HASM-celler som respons på 10 μM forskolin. Fluorescenshenfallskurver for biosensoren som respons på 10 μM forskolin. Hvert bilde ble tatt hvert 30 sekund i 20 minutter. Målestokk: 40 μM. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Time-lapse-video av sanntidsovervåking av cAMP i live HASM-celler som respons på 10 nM isoproterenol. Fluorescenshenfallskurver for biosensoren som respons på 10 nM isoproterenol. Hvert bilde ble tatt hvert 30 sekund i 20 minutter. Målestokk: 40 μM. Klikk her for å laste ned denne videoen.
| Medieformulering | |
| HASM medium | |
| Navn | Volum |
| Hams F-12K | 419,65 ml |
| FBS | 50 ml |
| HEPES (1M) | 12,5 ml |
| Natriumhydroksidoppløsning | 6 ml |
| L-glutamin 200 mM (100X) | 5 ml |
| Kalsiumklorid (1 M) | 0,850 ml |
| Antibiotika-antimykotisk (100X) | 5 ml |
| Primocin | 1 ml |
| HEK medium | |
| Navn | Volum |
| DMEM (1x) | 444 ml |
| FBS | 50 ml |
| Antibiotika-antimykotisk (100X) | 5 ml |
| Primocin | 1 ml |
Tabell 1: Medieformulering av HASM-medium og HEK-medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøyaktig og sensitiv måling av cAMP er avgjørende for å forstå dens rolle i ulike cellulære prosesser og for å studere aktiviteten til cAMP-avhengige signalveier. Det er flere metoder som vanligvis brukes for å måle cAMP-nivåer, inkludert ELISA, radioimmunanalyse, FRET-biosensorer og GloSensor cAMP-analysen 14,15,16,17,18. Hver cAMP-analyse har styrker og svakheter. Protokollen tillater sanntidsdeteksjon og overvåking, alt fra minutter til timer, og måling av cAMP-dynamikk i levende celler uten behov for å inkludere fosfodiesterasehemmere. Dette siste punktet er avgjørende for forskere som er interessert i å studere rollen til fosfodiesteraseisoformer i regulering av cAMP-signalering19. Biosensoren er tilgjengelig kommersielt (se materialtabell) i flere versjoner: en grønn fluorofor som reduserer fluorescens ved cAMP-binding, en rød fluorofor som viser økt fluorescens ved cAMP-binding, og en grønn fluorofor som viser økt fluorescens ved cAMP-binding. Den nedadgående versjonen av biosensoren er mest nyttig siden den viktigste begrensende faktoren er ekspresjonsnivået til biosensoren, og denne versjonen vil vise maksimal fluorescens ved baseline før du starter et eksperiment, noe som lindrer behovet for å vurdere biosensorekspresjon ved å legge til en maksimal cAMP-stimulus. Biosensoren er også tilgjengelig i versjoner som er rettet mot membranmikrodomener, primære flimmerhår eller til kjernen. Disse forskjellige versjonene muliggjør målinger av cAMP samtidig i cytosoliske og membran/ciliale rom i samme celle. Disse nye verktøyene er unikt dyktige til visualisering og kvantifisering av cAMP-dynamikk på tvers av forskjellige cellulære komponenter, et raskt utviklende og viktig studieområde20.
Biosensorene tilbyr en enkel metode for effektivt å overvåke cAMP-dynamikk i sanntid, slik at forskere kan observere raske endringer i cAMP-nivåer med eksepsjonell tidsoppløsning. En av de viktigste styrkene til biosensoren ligger i dens høye følsomhet, som gjør det mulig å oppdage både subtile og signifikante variasjoner i cAMP-konsentrasjoner8. Et eksempel på dette i cAMP-oscillasjonene er observert ved lave nivåer av isoproterenolstimulus i HEK-293-celler uten fosfodiesterase til stede (figur 2B). Denne oscillerende oppførselen er ikke forstått og virker unik for disse cellene, men følsomheten og den raske kinetikken til biosensoren gjør det mulig å oppdage dem. Det skal imidlertid bemerkes at biosensoren lett kan mettes, så denne biosensoren kan begrenses i å kvantifisere forskjellene mellom mellomstore og store cAMP-signaler. Denne begrensende funksjonen er spesielt relevant ved bruk av fosfodiesterasehemmere som forårsaker globale økninger i cAMP-nivåer når en reseptorstimulans også er tilstede. Mens vi presenterer infeksjonen av HASM i denne studien, er det viktig å erkjenne utfordringen forbundet med å infisere primærceller ved hjelp av BacMam-vektoren. Forholdene bør optimaliseres for individuelle celletyper for å oppnå tilstrekkelig ekspresjon av biosensoren. Ikke desto mindre gjør følsomheten og skalerbarheten til biosensoren den godt egnet for analyser med høy gjennomstrømning.
En annen forbedring ved å bruke denne biosensoren fremfor FRET-baserte sensorer er minimering av fotobleking. Mange fluorescerende biosensorer er utsatt for fotobleking etter langvarig og gjentatt eksitasjon. Protokollene beskrevet her involverer kortvarige eksitasjoner som er plassert 30 s fra hverandre. Biosensoren er også ekstremt lyssterk, og begrenser dermed potensiell fotobleking for denne typen analyser. Fotobleking vil bli observert under den første baseline-avlesningen som en drift. Hvis baseline-drift skulle oppstå, kan man trekke den drivende grunnlinjen fra dataene før man monterer kurven eller øke prøvetakingsintervallet for å redusere frekvensen av eksitasjon.
Som andre cAMP-biosensorer har denne biosensoren høy spesifisitet for binding til cAMP. Følgelig korrelerer signalene som genereres av denne analysen direkte med cAMP-nivåer, noe som reduserer potensiell interferens fra andre cellulære komponenter betydelig og gir pålitelige resultater. Videre er allsidigheten til biosensoren verdt å fremheve. Selv om GloSensor-analysen er mye brukt i felten, har den visse begrensninger. For eksempel kan det å stole på forbigående transfeksjon føre til ineffektivitet i spesifikke celletyper, og analysen av flere parametere eller prosesser i samme celle er en utfordring. I tillegg er analysen avhengig av luciferaseenzymer som kan påvirkes av visse forbindelser, noe som potensielt kan føre til kompromittert resultatnøyaktighet21. På den annen side kan biosensoren brukes i ulike celletyper og eksperimentelle systemer, inkludert adhesjons- og suspensjonsceller. Dens kompatibilitet med forskjellige cellulære kontekster gjør det mulig for forskere å undersøke cAMP-dynamikk på tvers av forskjellige biologiske systemer 22,23,24. Integrasjonen av denne biosensoranalysen med fluorescensmikroskopi forbedrer nytten ytterligere siden cellemorfologisk informasjon også kan samlesinn 25,26,27.
Denne analysen gir forskere stor fleksibilitet i eksperimentell design, noe som muliggjør et bredt spekter av undersøkelser relatert til cAMP-signalering. Det tjener flere formål, og muliggjør måling av basale cAMP-nivåer, studiet av cAMP-svingninger som respons på ulike stimuli eller behandlinger, og utforskning av cAMP-dynamikk under ulike fysiologiske eller patologiske tilstander. En av de viktigste styrkene til analysen er dens kompatibilitet med andre teknikker, noe som gir en mer omfattende forståelse av cAMP-signalering. Ved å kombinere biosensoren med metoder som immunfluorescensfarging eller genetisk manipulasjon10, kan forskere få dypere innsikt i den presise romlige og tidsmessige reguleringen av cAMP innenfor spesifikke cellulære rom eller signalveier. Gjennom denne integrasjonen kan forskere undersøke de ulike funksjonene til cAMP i ulike sammenhenger, noe som fører til verdifull innsikt i kompleksiteten til cAMP-medierte cellulære prosesser. Ved å bruke disse teknikkene kan forskere visualisere og kvantifisere cAMP-nivåer på både individcelle- og populasjonsnivå, og gi en omfattende forståelse av distribusjonen i cellen, inkludert identifisering av cAMP-bassenger. Som et resultat muliggjør kombinasjonen av disse metodene innsamling av presise data, noe som bidrar betydelig til vår kunnskap om cAMP-signalering.
Mens tradisjonelle metoder har vært verdifulle for cAMP-analyse, representerer introduksjonen av cADDis et lovende fremskritt på dette feltet. Dens spesifisitet, følsomhet og sanntidsevner gjør den til et verdifullt tillegg til forskerens verktøysett, spesielt på grunn av dens kompatibilitet med levende celler. Med muligheten til å overvåke cAMP-nivåer i sanntid og dens høye følsomhet, gir biosensoren en betydelig fordel i ulike eksperimentelle omgivelser. Denne fremgangen bidrar til en dypere forståelse av den dynamiske naturen til cAMP-signalering og dens funksjonelle implikasjoner i både fysiologiske og patologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
References
- Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
- Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C.
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
- Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
- Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
- Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
- Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
- Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
- Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
- Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
- Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
- Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
- Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
- Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
- Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
- Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
- De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
- Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
- Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
- Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
- Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
- Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).
