Summary
어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.
Abstract
유전자 치료는 기능적 유전자를 도입하거나, 독성 유전자를 비활성화하거나, 질병의 생물학적 특성을 조절할 수 있는 유전자를 제공하는 등 질병 치료를 위해 환자에게 새로운 유전자를 전달하는 강력한 기술입니다. 치료 벡터에 대한 전달 방법은 전신 전달을 위한 정맥 주입에서 표적 조직에 직접 주입에 이르기까지 다양한 형태를 취할 수 있습니다. 신경퇴행성 질환의 경우, 뇌 및/또는 척수 쪽으로 transduction을 치우는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 전체 중추신경계를 표적으로 하는 최소 침습적 접근법은 뇌척수액(CSF)에 주사하여 치료제가 중추신경계의 많은 부분에 도달할 수 있도록 하는 것입니다. 뇌척수액에 벡터를 전달하는 가장 안전한 방법은 척수의 요추 수조에 바늘을 삽입하는 요추 척수강내 주사입니다. 요추 천자라고도 하는 이 기술은 신생아 및 성인 설치류와 대형 동물 모델에 널리 사용되었습니다. 이 기술은 종과 발달 단계에 따라 유사하지만 척수강내 공간을 둘러싼 조직의 크기, 구조 및 탄성의 미묘한 차이로 인해 접근 방식에 적응이 필요합니다. 이 기사에서는 아데노 관련 혈청형 9 벡터를 전달하기 위해 어린 쥐에서 요추 천자를 수행하는 방법을 설명합니다. 여기에서 25-35 μL의 벡터를 요추 수조에 주입하고 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 사용하여 각 주입으로 인한 transduction profile을 평가했습니다. 이 접근 방식의 이점과 과제에 대해 설명합니다.
Introduction
바이러스 매개 유전자 치료의 가능성은 최근 몇 년 동안 척수성 근위축증, 망막 이영양증, 인자 IX 혈우병, 암 등에 대한 치료법에 대한 FDA 승인으로 마침내 실현되었습니다 1,2,3,4. 현재 수많은 다른 치료법이 개발 중입니다. 유전자 치료는 환자의 세포에 치료용 유전자를 전달하는 것을 목표로 합니다. 이 새로운 유전자의 산물은 결핍된 내인성 유전자에서 누락된 활성을 대체하거나, 독성 유전자를 억제하거나, 암세포를 죽이거나, 다른 유익한 기능을 제공할 수 있습니다.
중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 질환의 경우, 유전자 치료 벡터를 표적 조직에 직접 전달하는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 비체계적 접근법은 두 가지 이점을 제공합니다: 말초 transduction에 의해 야기될 수 있는 off-target 부작용을 최소화하고, target tissue에서 적절한 수준의 transduction을 달성하는 데 필요한 벡터의 양을 크게 줄입니다5.
유전자 치료 벡터를 중추신경계에 전달하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 벡터를 척수 또는 뇌 조직에 직접 주입하는 실질내 주사는 정의된 영역으로 전달하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나 많은 질병의 경우 중추신경계의 광범위한 전달이 필요합니다. 이는 뇌와 척수 안팎을 흐르는 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)5에 벡터를 전달하여 달성할 수 있습니다. CSF에 벡터를 전달하는 세 가지 주요 방법이 있습니다. 가장 침습적인 접근법은 뇌내주사 전달로, 두개골을 통해 버 구멍을 뚫고 뇌를 통해 측심실로 바늘을 전진시키는 것입니다. 이것은 뇌 전체에 형질전환을 일으킨다. 그러나, 이 시술은 두개내 출혈을 유발할 수 있으며, 이 접근법은 일반적으로 척수의 제한된 형질도입만을 생성한다6. 두개골 기저부에 있는 수조에 주입하는 것은 덜 침습적이지만 뇌간에 손상을 줄 위험이 있습니다. 동물연구에서 자주 사용되지만5, 수조 마그나(cisterna magna)에 주입하는 것은 더 이상 클리닉에서 일상적으로 사용되지 않는다7. 요추 천자는 뇌척수액에 접근하기 위한 가장 덜 침습적인 접근 방식입니다. 이것은 두 개의 요추 사이에 바늘을 삽입하고 요추 수조에 넣는 것을 포함합니다.
벡터 전달을 위한 요추 천자는 성인 쥐와 마우스 및 신생아 마우스에서 일상적으로 수행된다 8,9. 이 연구의 저자들은 최근 어린 쥐(생후 28-30일)에서 요추 천자를 수행하여 아데노 관련 바이러스 혈청형 9(AAV9) 벡터를 전달했습니다. 성체 쥐에서, 신생아 요추 천자 바늘을 L3 및 L4 척추9 사이에 수직으로 배치하였다. 적절하게 배치하면 꼬리가 튕기고 CSF가 바늘 저장소로 흘러 들어갑니다. 하지만 어린 쥐에서는 이러한 판독 결과 중 어느 것도 달성되지 않았습니다. 그런 다음 저자들은 L5와 L610 사이의 각도로 삽입된 27G 인슐린 주사기를 사용하여 성체 마우스 절차를 적용하려고 시도했습니다. 일반적으로 P28 쥐보다 작은 성체 마우스에서는 꼬리 튕김이 발생하지 않지만 주사액의 역류로 인해 잘못된 바늘 배치가 분명합니다. 그러나 어린 쥐에서는 이러한 접근 방식이 균일하게 주사액이 경막외 투여되도록 유도했는데, 이는 성체 쥐와 어린 쥐 사이의 척수를 둘러싼 조직층의 탄성이 다르기 때문일 수 있습니다. 다음으로 카테터 접근법을 평가했습니다. 구체적으로, 카테터는 요추 수조의 경막의 절개를 통해 중앙 흉부 척수까지 도입되었습니다. 그러나 이 접근법은 분만 중 주사액이 절개 부위 밖으로 상당히 역류하는 결과를 낳았습니다. 가이드 바늘을 사용하여 경피적으로 카테터를 척수강 내 공간에 삽입하려는 시도도 성공하지 못했습니다. 층간 폭이 좁기 때문에 카테터가 로스트랄 층에 부딪혀 전진하지 못할 가능성이 높습니다.
여기에서, 어린 쥐에서 요추 천자를 통해 성공적이고 재현 가능한 용액 전달을 달성하기 위한 방법이 설명됩니다. 이 접근법은 바이러스 벡터에 사용할 수 있으며 세포, 의약품 및 기타 치료제에도 사용할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구는 에모리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 Sprague-Dawley 쥐(생후 28-30일, 약 90-135g 범위의 질량, 수컷 및 암컷)를 사용했습니다.
1. 벡터의 준비
- 절차를 시작할 때 AAV9 벡터( 재료 표 참조)를 얼음에서 해동합니다.
- 벡터가 포함된 마이크로 원심분리기 튜브를 탁상형 원심분리기에서 잠시 원심분리하여 모든 액체가 튜브 바닥에 있는지 확인합니다.
- 미세 원심분리기 튜브를 부드럽게 튕겨 용액이 잘 혼합되도록 합니다.
2. 회수 케이지의 준비
- 깨끗한 케이지를 전기 담요 위에 놓고( 재료 표 참조) 케이지의 절반만 담요와 접촉하도록 합니다.
- 담요의 온도를 ~37°C로 설정합니다.
3. 수술 플랫폼의 준비
- 등온 패드( 재료 표 참조)를 전자레인지나 수조에서 39°C로 데우면 내용물이 액체가 됩니다.
- 등온 패드를 수술 플랫폼에 놓고 깨끗한 흡수성 벤치 패드로 덮습니다.
4. 동물 준비
- 투명한 상자에 담긴 이소플루란으로 쥐를 마취합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 5% 이소플루란을 사용하여 마취 유도를 시작하고 2%에 도달할 때까지 분당 1%씩 단계적으로 내려갑니다. 추가로 3분 동안 동물을 2%로 유지합니다.
- 동물이 들어 있는 상자를 흄 후드로 옮기고 상자를 엽니다.
참고: 이것은 외과의가 마취제에 노출되는 것을 제한합니다. - 전기 이발기를 사용하여 동물의 뒤쪽에서 털을 제거하십시오.
알림: 또는 제모 크림 또는 수동 면도기 및 면도 크림을 사용할 수 있습니다. - 마취 코뿔에 주둥이를 놓고 동물을 수술 플랫폼에 놓습니다.
참고: 수술 부위에서 털을 제거하는 동안 동물은 의식을 회복하기 시작할 수 있습니다. 이 경우 위에서 설명한 대로 다시 마취하십시오. - 시술 중 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 각 눈에 윤활 눈 연고를 바르십시오.
- 포비돈-요오드와 이소프로판올 물티슈를 번갈아 가며 사용하여 수술 부위를 소독합니다.
- 진통제를 피하로 주사합니다.
참고: 부프레노르핀은 일반적으로 0.01-0.05mg/kg의 용량으로 사용되며 12시간마다 제공됩니다. 양자택일로, 이 약의 느리 방출 모양은 1 mg/kg에 72 시간 동안 충분한 고통 통제를 제공하기 위하여 1 번 주어질 수 있습니다. 통증 관리에 관한 지침에 대해 해당 기관의 IACUC와 상의하십시오. - 100 μL의 1% 리도카인을 L2 - L6 가시돌기 위에 피하로 주사하여 국소 마취를 제공합니다.
- 종이 타월 롤이나 지름 1.5cm의 튜브를 동물 아래에 놓고 엉덩이까지 오게하십시오. 이렇게 하면 척추를 구부려 두 층판 사이에 바늘을 더 쉽게 삽입할 수 있습니다.
- 창호가 있는 드레이프( 재료 표 참조)를 동물에 놓고 창호를 요추 위의 중앙에 놓습니다.
5. 요추 노출
- 동물의 각 발을 꼬집고 금단 반응이 없는지 확인하여 마취 깊이를 확인합니다.
- #11 메스 칼날을 사용하여 L2에서 L6까지 정중선을 따라 피부에 약 3cm 길이의 절개를 만듭니다.
- 근육과 피부 사이에 멸균 곡선형 수술용 가위를 삽입한 다음 끝부분을 열어 근육에서 피부를 풉니다.
- L2-L5 가시돌기를 덮고 있는 근막을 제거합니다.
6. 주사기 장전
- 벡터의 25-35 μL(원하는 용량을 얻기 위해)를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브의 캡에 피펫팅합니다.
- 전체 부피를 인슐린 주사기에 넣습니다.
알림: 이 과정에서 공기를 흡입하지 않도록 주의하십시오.
7. 주입 수행
- L5 및 L4 가시돌기를 식별합니다.
참고: L6은 두 개의 장골 능선 사이에 직접 위치하며, 그 가시 돌기는 뭉툭한 도구로 조사하여 쉽게 식별할 수 있어야 합니다. 그런 다음 기기를 뒤쪽으로 부드럽게 올려 L5 및 L4 프로세스의 경계를 찾을 수 있습니다. - 엄지손가락이 동물의 꼬리와 한쪽 다리에 부드럽게 닿도록 한 손을 놓습니다. 손가락을 사용하여 주사기를 고정합니다.
- 주사기의 바늘을 L5 가시돌기의 왼쪽에 있고 꼬리 끝과 일직선이 되도록 배치합니다. 주사기가 정중선에서 약 30°, 테이블 평면에서 30° 위로 향하도록 배치합니다.
알림: 랜드마크를 더 잘 식별하고 바늘 끝의 위치를 지정하기 위해 수술용 현미경을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. - 주사 바늘을 L5 라미나 상단 위로 약 8mm 앞으로 전진시킨 다음 L4 라미나 아래로 요추 수조로 뼈가 부딪힐 때까지 전진시킵니다. 올바르게 배치하면 다리 및/또는 꼬리가 경련되어 다리/꼬리에 놓인 엄지손가락으로 보거나 느낄 수 있습니다. 경련이 없으면 바늘을 제거하고 왼쪽에서 시술을 시도하십시오. 그래도 경련이 없으면 필요에 따라 L4/L3와 L3/L2 사이에서 절차를 반복합니다.
- 플런저를 약 5초 동안 천천히 누릅니다.
알림: 주사 중 다리나 꼬리에 경련이 있을 수 있습니다. - 플런저를 완전히 누른 후 약 30초 동안 주사기를 제자리에 유지하여 압력이 평형을 이루도록 하고 바늘을 빼낼 때 주입액의 역류를 최소화합니다.
- 바늘을 천천히 제거하십시오.
8. 절개 부위의 봉합
- 절개 부위의 가장자리를 근사화합니다.
- 상처의 한쪽 끝에서 시작하여 4-0 봉합사( 재료 표 참조) 또는 수술용 스테이플을 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
9. 복구 및 모니터링
- 미리 데워진 케이지에 동물을 넣으십시오.
- 완전히 보행할 수 있을 때까지 최소 15분마다 동물을 확인하십시오.
참고: 15분에서 45분 정도 소요됩니다. - 다음 3일 동안은 적어도 매일 건강 검진을 실시하십시오. 수술 후 처음 2일 동안 또는 IACUC의 요구에 따라 진통제를 제공합니다.
- 수술 후 일주일 후에 봉합사나 스테이플을 제거합니다.
10. 사후 관리 절차
참고: 주입 기술의 정확성을 확인하려면 위에서 설명한 대로 트리판 블루 염료를 주입한 다음 동물을 즉시 안락사시키고(제도적으로 승인된 프로토콜에 따라) 후궁 절제술을 수행하여 결과를 시각화합니다.
- 동물이 마취 상태에 있는 동안에는 150mg/kg의 복강 내 주사를 통해 치사량의 펜토바르비탈을 투여하여 안락사시킵니다.
- 호흡과 심장 활동이 멈추면 흉강을 열어 사망을 보장합니다. 수술 절개 부위를 뒤쪽에서 목까지 확장합니다.
- 가시돌기의 양쪽에서 척추와 평행한 근육을 4cm 길이로 절개하여 가시돌기에 최대한 가깝게 유지합니다.
- 가는 집게나 가위를 사용하여 가시돌기 사이의 근육을 제거합니다.
- rongeur를 사용하여 L6에서 하부 흉추까지의 가시 돌기를 제거합니다( 재료 표 참조). 비틀는 동작은 rongeurs를 손상시킬 수 있으므로 피하십시오.
- 롱게르의 아래쪽 끝부분을 L5 라미나 아래에 삽입하고 척수 위에 있는 뼈를 여러 번 "물기"를 제거하여 제거합니다.
참고: L6 가시돌기를 뒤로 당기면 롱게르의 끝부분을 더 쉽게 삽입할 수 있습니다. 척수가 손상되지 않도록 주의를 기울여야 합니다. - 후궁 절제술을 계속 확장하여 적어도 4 개의 라미네를 rostrally. 라미네의 내부 표면에 주입 실패를 나타낼 수 있는 염료의 흔적이 있는지 검사합니다.
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Representative Results
주입 기술의 정확성을 결정하기 위해, 염료인 트리판 블루(trypan blue)를 치료제의 대리물로 사용하였다. 이 염료는 단백질에 쉽게 결합하므로 일반적으로 주입된 구조 내에 머뭅니다. 이는 염료가 치료제의 주사 후 분포를 정확하게 예측하지 못할 수 있음을 의미합니다. 단순히 주입의 정확도를 밝히는 데 사용됩니다. 요추 수조에 성공적으로 주입되면 트리판 블루가 경막에 결합하여 척수 주변을 파란색으로 염색합니다. 그러나 바늘이 경막을 관통하지 못하면 염료는 경막외 공간에서 끝납니다. 경막과 주변 조직(뼈 표면과 층막을 연결하는 인대와 근육)은 모두 파란색으로 염색됩니다. 이러한 패턴은 육안으로 쉽게 볼 수 있습니다.
올바르게 투여된 주사와 잘못 투여된 주사의 차이는 단순히 척수와 척추를 가로로 절개하는 경우에는 평가하기 어렵습니다. 대신, L5 라미나에서 시작하여 로스트랄로 움직이는 한 쌍의 롱거를 사용하여 후궁 절제술을 수행하는 것이 좋습니다. 이 과정에서 경막이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 해부 현미경을 사용하면 이 과정이 더 쉬워집니다. 그림 1 은 성공적인 주입과 부분적으로만 성공한 주입의 비교 예를 제공합니다. 성공적인 주입을 통해 바늘을 빼낼 때 바늘 트랙을 따라 역류가 거의 또는 전혀 관찰되지 않습니다. 성공적으로 주입한 후 박판을 제거하여 척수를 노출시키면 척수 내에 트리판 블루가 나타나지만 뼈 표면에는 나타나지 않습니다(그림 1A). 염료는 성공적인 주입 후 뇌간과 소뇌에서도 볼 수 있습니다(그림 1B). 이와는 대조적으로, 부분적으로 성공적인 주입은 주입 과정에서 염료가 바늘 관을 역류하여 상당한 역류를 일으키거나 뼈에 염료가 눈에 띄게 나타나 있음을 알 수 있습니다(그림 1C).
위의 절차를 사용하여 향상된 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 AAV9 벡터 28μL를 3 x 1013 벡터 게놈/mL의 농도로 주입하여 총 용량은 8.4 x 1011 벡터 게놈/동물입니다. 4주 후, 동물들은 안락사되고 4% 파라포름알데히드10으로 관류되었다. 그런 다음 뇌와 척수를 채취하여 동결 절편을 준비했습니다. 40 μm 두께의 절편을 얻어 GFP에 대해 염색하였다. 그림 2는 이 벡터로 얻어진 transduction pattern의 예를 제공합니다. 형질도입은 일반적으로 척수, 특히 요추 부위에서 가장 높았는데(그림 2A-C), 이는 주사 부위와의 근접성 때문일 수 있습니다. 뇌의 형질도입은 이루어졌지만(그림 2D-F), 예상대로 척수에서 보이는 것보다 더 제한적인 경향을 보였다.
경험이 풍부한 한 명의 외과 의사가 단일 로트의 바이러스를 사용하여 달성한 결과의 재현성을 설명하기 위해 이 연구를 위해 주입된 15마리의 쥐 각각에서 소뇌와 피질의 염색된 부분이 각각 그림 3 과 그림 4에 제시되어 있습니다. 경추 척수의 염색된 부분은 또한 이 15마리의 쥐 중 7마리에 대해 제시되었습니다(그림 5). 물론, 뇌 형질도입의 양은 투여량, 벡터 로트, 그리고 외과 의사에 따라 훨씬 더 큰 변동성을 보일 수 있다10.
그림 1: 염료 주입 후 척수의 노출. 후궁 절제술은 trypan blue를 주입한 후 수행되었습니다. (A) 정확하게 투여된 주사로 척수가 파란색으로 염색되어 있고, 후궁 절제술(화살표) 중에 제거된 뼈에 염료가 보이지 않습니다. (B) 염료는 뇌간 주변에서도 관찰할 수 있습니다. (C) 주입 중 역류가 심한 주사의 경우, 탯줄 내에 염료가 적고 뼈 표면(화살표)에 염료가 존재합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: AAV9-GFP의 척수강내 전달 후 달성된 형질도입 패턴의 예. (A) 경추, (B) 흉추 및 (C) 요추 척수의 40μm 두께 절편을 GFP(블랙 염색)에 대해 면역조직화학적으로 염색했습니다. 모든 수준에서 높은 수준의 회백질 전달이 관찰되었습니다. (D) 대조적으로, 뇌는 전반적인 전달이 더 희박합니다. 왼쪽 및 오른쪽 상자는 각각 (E) 및 (F)로 확대됩니다. (E) 대부분의 염색은 소뇌, 주로 Purkinje 뉴런(화살표)에서 관찰됩니다. (F) 뉴런(화살표)과 성상세포(화살촉)는 대뇌피질 내에서 전달됩니다. 눈금자: (A-C) 325 μm; (D) 5mm; 및 (E,F) 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 소뇌에서의 transduction의 재현성. 동일한 용량과 많은 양의 바이러스를 사용하여 동일한 외과의가 주입한 15마리의 쥐의 소뇌에서 형질도입의 재현성. 눈금자: 1mm. 이미지의 숫자는 쥐 ID 번호('쓰레기')를 나타냅니다. 개인'). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 피질에서의 transduction 재현성. 동일한 용량과 많은 바이러스를 사용하여 동일한 외과의가 주입한 15마리의 쥐의 피질에서 형질도입의 재현성. 눈금자: 500 μm. 이미지의 숫자는 쥐 ID 번호('쓰레기')를 나타냅니다. 개인'). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 경추 척수에서의 transduction의 재현성. 동일한 용량과 많은 바이러스를 사용하여 동일한 외과의가 주입한 7마리의 쥐의 경추 척수에서 형질도입의 재현성. 눈금자: 500 μm. 이미지의 숫자는 쥐 ID 번호('쓰레기')를 나타냅니다. 개인'). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다양한 질병이 중추신경계에 영향을 미칩니다. 바이러스 벡터를 통해 관련 유전자의 기능적 사본을 제공하는 것은 척수성 근위축증과 같이 본질적으로 열성 및 단일 유전자 질환에 매력적인 치료 전략입니다. 그러나 혈액-뇌 장벽(BBB)은 정맥 주사로 투여되는 대부분의 유전자 치료 벡터를 제외합니다11. AAV9와 같이 BBB를 통과할 수 있는 것들은 말초 transduction으로 인한 벡터 손실을 극복하기 위해 고용량으로 투여해야 한다12. 나이도 장벽입니다. 다양한 AAV 혈청형에 대한 환경적 노출은13 세에 따라 증가하며, 종종 치료용 벡터를 중화할 수 있는 항체의 생성으로 이어진다14. 따라서 중추신경계 질환에 대한 유전자 치료 벡터의 정맥 투여는 일반적으로 영아에 국한되며 노년기에 진단된 환자에게는 사용되지 않습니다.
고령 환자의 경우, 뇌척수액에 벡터를 직접 주입하면 BBB와 기존의 항-AAV 항체를 모두 우회하여 중추신경계에서 광범위한 transduction을 생성할 수 있다15. 이 접근법은 표적화되어 있기 때문에 더 낮은 벡터 용량도 사용할 수 있습니다. 임상 환경에는 (1) 요추 천자와 (2) 측심실에 주입하는 두 가지 주요 접근 방식이 있습니다. 후자는 더 많은 위험을 수반하지만 일반적으로 더 큰 뇌 전달을 제공합니다. 요추 천자는 더 안전하지만 형질도입은 척수 쪽으로 치우쳐 있습니다. 뇌 형질도입은 환자를 트렌델렌부르크 자세(Trendelenburg position)에 놓음으로써 향상될 수 있지만, 이에 대한 데이터는 혼합되어 있다16,17. 요추 천자를 통해 수조에 도달하기 위해 카테터를 사용하는 것이 클리닉에서 더 나은 선택을 제공할 수 있지만, 이는 사용 초기 단계에 있다5. 동물모델에서 연구된 접근법을 임상에 적용하는 데에는 뇌척수액 누출로 인한 벡터 손실(vectorloss by CSFleakage) 18 및 등뿌리핵(dorsal root ganglia)19의 독성과 같은 다른 어려움이 있을 수 있다.
설치류에서 수행된 CNS 지시 요법에 대한 대부분의 연구는 신생아 또는 성체 동물(생후 60일 >)을 사용합니다. 네오네이트는 신체 크기가 작아 더 효과적인 투여량을 허용하고 미성숙한 면역 체계가 있어 치료제에 대한 면역 반응의 합병증을 피할 수 있는 이점이 있습니다. 그러나 뇌 발달 측면에서 갓 태어난 쥐나 쥐는 인간의 태아 단계를 더 잘 나타냅니다. 5-10세 연령대의 어린이를 대상으로 하는 치료법의 경우, 어린 쥐(생후 25-35일)가 신경학적 발달 측면에서 더 나은 모델이다20. 척수강내 주사를 위한 방법은 이전에 어린 쥐에 대해 기술된 적이 없었고, 성인 마우스와 랫트에 대해 확립된 방법이 이 연령의 쥐에서는 효과가 없는 것으로 판명되었기 때문에, 위에서 설명한 접근법이 개발되었다. 분명히 말하자면, 어린 쥐는 성체보다 작을 뿐만 아니라 척수를 보호하는 경막의 탄력성에도 차이가 있을 수 있기 때문에 성인 쥐에서 이 층을 뚫는 방법은 어린 쥐에게는 효과적이지 않습니다.
어린 쥐에서 척수강내 주사를 수행하는 방법을 배울 때 염료(예: 트리판 블루)를 치료의 대리물로 사용하는 것이 필요하며, 사용자는 치료제로 연구를 시작하기 전에 절차를 성공적이고 재현성 있게 수행할 수 있는 능력에 대해 높은 확신을 가져야 합니다. 이 기술에 능숙해지려면 궤적이 표적에 있을 때와 표적을 벗어났을 때 주사기가 어떻게 느껴지는지에 대한 경험을 얻기 위한 연습이 필요합니다. 두 가지 일반적인 오류가 있습니다. 접근 각도가 너무 얕으면 바늘이 라미나 중 하나의 상단 또는 로스트랄 라미나의 뒤쪽에 부딪힙니다. 경련이 없으며 바늘이 전진하는 거리는 8mm에서 몇 밀리미터 짧습니다. 접근 각도가 너무 크면 바늘이 두 층 사이를 통과하여 복강을 관통할 위험이 있습니다. 이 경우 바늘은 8mm보다 훨씬 더 멀리 전진합니다. 이 경우 바늘을 제거하고 위치를 변경한 다음 다시 시도하십시오. 이런 일이 발생한 몇 가지 경우에는, 철수 및 재배치가 이루어지기 전에 몇 밀리미터 정도 일시적으로 복강으로 들어가는 것이 동물에게 명백한 지속적인 해를 끼치지 않았습니다.
바늘 배치에 대한 물리적 반응을 관찰하는 것이 이 절차로 높은 성공률로 재현성을 달성하는 데 중요하다는 것이 밝혀졌습니다. 반응이 없을 때는 주사 성공률이 낮았습니다. 그러나 어떤 경우에는 동물이 반응을 얻기 위해 여러 부위를 시도해야 했으며 이전 바늘 트랙 중 하나 이상에서 미량의 염료가 관찰되었습니다. 경막외 공간에서는 염료가 관찰되지 않았으며, 이는 이전의 바늘 막대기 중 일부가 꼬리나 다리의 경련을 일으키지 않고 경막을 관통했음을 시사합니다. 역류가 미미했기 때문에(주사 후 바늘 트랙에서 관찰된 것과 유사), 이러한 사례에서 이전 바늘 스틱이 전달 효능에 미치는 영향은 무시할 수 있는 수준이었던 것으로 생각됩니다.
일단 전달 기술에 숙달되면 두 번째 비수술적 도전에 직면할 수 있습니다. 특히, 성체 쥐(생후 ~70일)에서 척수와 뇌로의 척수강내 전달을 위한 AAV9 벡터의 효능은 동일한 벡터 코어에 의해 생성되는 경우에도 로트마다 크게 다를 수 있습니다. 일부 배치는 예상대로 수행되어 척수 회백질의 길이를 따라 형질(transduction)을 생성합니다. 그러나 다른 것들은 회백질을 관통하지 못하며, 주로 등뿌리 신경절(dorsal root ganglia)10을 transduction한다. 이러한 변동성의 원인은 명확하지 않은데, 그 이유는 벡터가 시험관 내에서 그리고 척수에 직접 주입될 때 강력하기 때문입니다. 대규모 연구를 시작하기 전에 새로운 바이러스 배치에 대해 3-4마리의 동물에 대한 파일럿 연구를 수행하여 새로운 로트가 예상대로 작동하는지 확인하는 것이 좋습니다. 효능은 단백질 전이유전자 산물의 면역조직화학적 또는 면역형광 염색을 사용하여 평가하거나 정량적 PCR 또는 ddPCR21을 사용하여 전이유전자 mRNA 또는 벡터 게놈의 양을 정량화할 수 있습니다. 바이러스 로트를 구별하는 알려지지 않은 변수 외에도 동물의 나이, 주입량, 전달 속도 및 벡터 농도의 작은 차이로 인해 결과에 변동이 발생할 수 있습니다. 대규모 연구를 시작하기 전에 각 바이러스 또는 다른 후보 치료제에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다.
일단 훈련을 받으면 경험 많은 외과 의사는 마취 유도부터 회복 기간 시작까지 약 30분 이내에 어린 쥐의 척수강내 주사 절차를 완료할 수 있습니다. 이를 통해 짧은 시간 내에 대규모 코호트를 치료할 수 있습니다. 수술 후 회복도 빠르다. 대부분의 동물은 보통 20-30분 이내에 보행합니다. 이러한 수술을 200회 이상 시행한 후에도 이 수술로 인한 부작용은 발생하지 않았습니다.
마지막으로, 수술 과정에서 동물의 고통을 최소화하고 동물 복지를 보장하는 것이 가장 중요한 고려 사항입니다. 따라서 마취제와 진통제의 적절한 사용이 필요하며, 시술 중 그리고 동물이 마취에서 완전히 회복될 때까지 체온을 유지해야 합니다. 다른 기관의 관련 규제 기관 및 수의학 직원은 이러한 주제에 대해 서로 다른 요구 사항과 권장 사항을 가질 수 있습니다. 이 절차에 설명된 마취제 및 진통제의 사용은 에모리 대학 수의사 및 IACUC 직원과 상의하여 개발되었습니다. 연구자들은 필요한 목표를 달성하기 위해 지역 수의사 및 IACUC와 긴밀히 협력해야 합니다.
이 절차에는 특정 제한 사항이 있습니다. 여기에 설명된 방법은 어린 쥐에서 사용하기 위해 개발되었으며, 인간과 쥐 사이의 무수한 구조적 및 기타 차이점으로 인해 이러한 절차를 인간에게 번역하는 것이 제한될 수 있습니다. 어린 쥐에서 치료제의 요추 척수강내 주사를 가능하게 하는 요점은 환자에게 적용하기 위해 정확한 전달 방식을 변경해야 하는 경우에도 후보 치료 치료의 효능을 테스트하기 위해 어린 쥐 모델의 사용을 용이하게 하는 것입니다.
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Disclosures
Donsante 박사는 AAV9 벡터의 CSF 투여와 관련하여 출원 중인 특허의 발명자입니다.
Acknowledgments
저자들은 척수강내 주사를 위해 어린 쥐가 제기하는 도전에 대해 생산적인 토론을 해준 UT Southwestern의 Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi 및 Lacey Stearman에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구는 Jaguar Gene Therapy(JLFK로)의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
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