וידאו זה מדגים כל הר אימונוהיסטוכימיה, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של אנטיגן ניתן דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג'יין דוד וטום Jessell.
Abstract
עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, הופכים אותו לכלי אידיאלי ללימוד ביטוי הנוגדן בפיתוח, המוח צינור somite עצביים. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים מכתים כל הר נוגדנים באמצעות נוגדנים HRP משני מצומדות: ראשית, העובר גזור מן הביצה ואת קבוע paraformaldehyde. Peroxidase שנית, אנדוגני הוא מובטל, העובר חשוף ואז נוגדן ראשוני. לאחר מספר שוטף, העובר הוא מודגרות עם נוגדנים משני מצומדות כדי HRP. פעילות peroxidase מתגלה באמצעות תגובה עם המצע diaminobenzidine. לבסוף, העובר מקובע ומעובד צילום חתך. היתרון של שיטה זו על השימוש של נוגדנים ניאון היא כי עוברי יכול להיות מעובד על חתך שעווה, ובכך לאפשר לימוד של אתרי אנטיגן חתך. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג'יין דוד וטום Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
I. סקירה סכמטית: סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים אימונוהיסטוכימיה הר שלם בעובר האפרוח. ראשית, העובר הוא קבוע PFA [IHC1]. ואז, פעילות peroxidase אנדוגני הוא הרווה [IHC2]. העובר הוא מודגרות אז הנוגדן העיקרי [IHC3]. לאחר מספר שוטף, העובר הוא מוד?…
Discussion
סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בביצוע כל הר מכתים נוגדן בעוברים אפרוח צעיר. פרוטוקול זה משמש בעיקר לאפיון במרחב ובזמן של נוגדנים הרומן חומוס 2,3, כמו גם לשימושם של סמנים antigenic ידוע כדי לקבוע מומים עובריים הבאים להעליב 4.
Acknowledgements
נוגדנים חד שבטיים (15.3B9, PAX7) שפותח על ידי (J. Dodd, TM Jessell וא Kawakami) התקבלו בנק Hybridoma מחקרים התפתחותיים שפותחה בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה מדעים ביולוגיים , איווה. DP הוא חתן פרס רות Kirschstein DA021977 1F32-01A1 מן המכון הלאומי האמריקני לשימוש בסמים. עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
Outro
Lyon
RX
Curved Forceps (1)
Tool
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Tool
Fine Science Tools
11002-13
Fine scissors
Tool
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microdissecting knife
Tool
Fine Science Tools
10056-12
Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA
Reagent
Electron Microscopy Sciences
15710
30% H2O2
Reagent
Sigma
H1009
BSA
Reagent
Sigma
A3803
NGS
Reagent
Jackson Immuno
005-000-121
Primary Antibodies
Reagent
Developmental studies Hybridoma Bank
4G11, 15.3B9, PAX7
For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)
Reagent
Jackson Immuno
115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride
Reagent
Pierce
34001
Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.