Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick
Summary
Questo video dimostra tutta montare immunoistochimica, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale di un antigene può essere visualizzata in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell.
Abstract
L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare l'espressione di anticorpi nello sviluppo del cervello, del tubo neurale e somite. Questo video mostra le diverse fasi, in tutto il montaggio colorazione anticorpale utilizzando anticorpi coniugati con HRP secondaria; In primo luogo, l'embrione è sezionato dall'uovo e fissati in paraformaldeide. In secondo luogo, perossidasi endogena è inattivato; L'embrione viene quindi esposto a anticorpo primario. Dopo numerosi lavaggi, l'embrione viene incubato con l'anticorpo secondario coniugato con HRP. Perossidasi viene rivelato tramite la reazione con il substrato diaminobenzidina. Infine, l'embrione è fisso ed elaborati per la fotografia e sezionamento. Il vantaggio di questo metodo rispetto all'uso di anticorpi fluorescenti è che gli embrioni possono essere trattati per sezionamento cera, permettendo così lo studio dei siti antigene nella sezione trasversale. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
Discussion
Questo video mostra le varie fasi di esecuzione di tutto il montaggio colorazione anticorpi in embrioni di pollo giovani. Questo protocollo è essenzialmente utilizzato per la caratterizzazione spaziale e temporale di anticorpi romanzo in pulcino 2,3, così come per l'uso di marcatori antigenica nota per determinare malformazioni embrionali seguenti insulto 4.
Acknowledgements
Gli anticorpi monoclonali (15.3B9, PAX7) sviluppato da (J. Dodd, TM Jessell e A. Kawakami) sono stati ottenuti dalla Banca dello Sviluppo Studi Ibridoma sviluppato sotto l'egida del NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Scienze biologiche , Iowa. DP è destinatario del Premio Ruth Kirschstein DA021977 1F32-01A1 dal National Institute on Drug Abuse. Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Outro | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson Immuno | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson Immuno | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
Referências
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
