Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording
Summary
Dies ist eine Anleitung zum Ändern der Form von Glas-Mikropipetten. Insbesondere durch Anwendung von Wärme und Luftdruck der Verjüngung ist ohne Erhöhung des Bahnöffnung verbreitert, was zu niedrigeren Pipette Widerstand. Dies ist entscheidend für rauscharme Aufnahmen von kleinen Zellen zu erhalten, sondern ist in vielen Anwendungen.
Abstract
Pressure-Polieren ist ein Verfahren zur Formgebung Glaspipetten für Patch-Clamp-Aufzeichnung. Zunächst entwickelte diese Methode zur Herstellung von Pipetten geeignet für die Aufnahme von kleinen (<3 m) neuronalen Zellkörpern. Das Grundprinzip ist ähnlich wie Glasblasen und verbindet Luftdruck und Wärme, um die Form von Patch-Pipetten mit einem herkömmlichen Mikropipette puller vorbereitet zu ändern. Es kann zu sogenannten weichen (Natronkalk) und schwer (Borosilikatglas) Gläser aufgebracht werden. Generell Druck Polieren kann Pipette Widerstand um 25% zu reduzieren, ohne die Verringerung der Durchmesser der Spitze Öffnung (Goodman und Lockery, 2000). Es kann praktisch jede Art von Glas aufgetragen werden und erfordert nur die Hinzufügung eines Hochdruck-Ventil und Montage an einem microforge. Diese Technik ist wichtig für die Aufnahme von ultrakleinen Zellen (<5 m) und können auch zur Verbesserung Einkanal-Aufnahme durch die Minimierung Pipette Widerstand. Die stumpfe Form ist auch für perforierte-Patch-Clamp-Aufzeichnung nützlich, da diese Form der Spitze führt zu einer größeren Membran bleb für Perforation.
Protocol
Discussion
Wir hatten ursprünglich entwickelte diese Methode, um Pipetten nützlich für Patch-Clamp-Aufnahme von 2-3 um Neuronen in C. elegans 1. Es ist in den Routineeinsatz im Labor Goodman. Wir Druck-polnisch-Pipetten nicht nur für die Aufnahme von kleinen C. elegans Neuronen, sondern auch für den Erhalt macropatch und Single-Channel-Aufnahmen von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert. Für eine gegebene Tipp-Öffnungsdurchmesser, produziert die stumpfe Form einer niedrigeren Widerstand Pipette. Untere Pipette…
Acknowledgements
Der Druck-Polier-Technik wurde in Zusammenarbeit mit SR Lockery entwickelt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glass Capillaries | Consumable | Sutter Instruments | BF150-85-10 (or similar) | The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament. |
| Inverted Microscope | Microscope | Leica | DM IL (or similar) | Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose. |
| Microforge Kit | Tool | ALA Science | CPM-2 | Supplies polishing coil, controller and foot pedal. |
| Air pressure source | Tool | ALA Science | PR-60 | Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below) |
| 4-way valve | Tool | Cole-Parmer | A-98150-01 | Fittings will be needed to couple valve to tubing |
| Pipette Holder with Luer Connector | Tool | World Precision Instruments | MPH-6S20 | Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing |
| Tygon® tubing | Tool | Cole-Parmer | 06408-62 | Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve |
Referências
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
