Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Summary

Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.

Abstract

Pressione lucidatura è un metodo per modellare pipette di vetro per patch-clamp registrazione. In primo luogo abbiamo sviluppato questo metodo per la realizzazione di pipette adatto per la registrazione di piccole dimensioni (<3 m) corpi cellulari neuronali. Il principio di base è simile al vetro soffiato e combina la pressione dell'aria e del calore per modificare la forma di pipette di patch preparata da un estrattore micropipetta convenzionale. Può essere applicato ai cosiddetti soft (calce sodata) e difficile (borosilicato) occhiali. In generale, la lucidatura della pressione può ridurre la resistenza pipetta del 25% senza diminuire il diametro dell'apertura punta (Goodman e Lockery, 2000). Può essere applicato a qualsiasi tipo di vetro e richiede solo l'aggiunta di un valvola di alta pressione e montato su un microforge. Questa tecnica è essenziale per la registrazione da cellule ultrasmall (<5 m) e può anche migliorare singolo canale di registrazione, riducendo al minimo la resistenza pipetta. La forma smussata è utile anche per la registrazione perforata-patch clamp, perché i risultati in forma di questa punta una bozza membrana più disponibile per la perforazione.

Protocol

Pipette tirando Utilizzando un filamento estrattore come un Sutter P-97 Flaming Puller microelettrodo / Brown, tirare un insieme di circa 10-20 pipette. Seleziona il tuo bicchiere. Noi usiamo borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Conservare con cura il vetro in modo che rimane pulito e senza polvere. Progettare un programma di trazione. L'obiettivo primario è una punta di apertura circa la dimensione desiderata, che dipende dalla applicazione. Sutter P-97 Cookbook Pi…

Discussion

Inizialmente abbiamo sviluppato questo metodo per pipette utile per patch-clamp registrazione 2-3 micron neuroni in C. elegans ^1. E 'in uso di routine nel laboratorio Goodman. Noi pipette pressione smalto non solo per la registrazione da piccolo C. elegans neuroni, ma anche per l'ottenimento di registrazioni macropatch e single-channel dei canali ionici espressi in ovociti di Xenopus. Per un dato in punta di apertura del diametro, la forma smussata produce una minore resistenza pipetta. Resistenza pipett…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instruments	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve