Pulido a presión para la Mejora de pipetas de patch-clamp grabación
Summary
Esta es una guía para modificar la forma de pipetas de vidrio. En concreto, mediante el uso de calor y presión de aire el cono se ensancha sin aumentar la apertura de la punta, lo que lleva a la resistencia a la pipeta inferior. Esto es fundamental para conseguir grabaciones de bajo nivel de ruido de células pequeñas, pero es útil en muchas aplicaciones.
Abstract
La presión de pulido es un método para dar forma a las pipetas de vidrio para la grabación de patch-clamp. En primer lugar, desarrolló este método para la fabricación de pipetas adecuado para la grabación de los pequeños (<3 m) los cuerpos de las células neuronales. El principio básico es similar al de soplado de vidrio y combina la presión del aire y el calor para modificar la forma de pipetas parche preparado por un extractor de micropipeta convencionales. Se puede aplicar a las llamadas blandas (refresco de limón) y difícil de anteojos (borosilicato). En términos generales, el pulido de presión puede reducir la resistencia a la pipeta en un 25% sin disminuir el diámetro de la abertura de la punta (Goodman y Lockery, 2000). Se puede aplicar a prácticamente cualquier tipo de vidrio y sólo requiere la adición de una válvula de alta presión y la instalación de un microforge. Esta técnica es esencial para la grabación de las células ultra (<5 m) y también puede mejorar de un solo canal de grabación, reduciendo al mínimo la resistencia a la pipeta. La forma contundente es también útil para la grabación de la abrazadera perforada del parche ya que los resultados de la punta en forma de una vesícula de membrana más grande disponible para la perforación.
Protocol
Discussion
Lo que originalmente se desarrolló este método para pipetas útil para la grabación de patch-clamp 2-3 micras neuronas en C. elegans 1. Es en el uso rutinario en el laboratorio de Goodman. Estamos a la presión de uñas pipetas no sólo para la grabación de pequeñas C. neuronas elegans, pero también para la obtención de grabaciones macropatch y de un solo canal de los canales iónicos expresados en ovocitos de Xenopus. Para que una punta de apertura de diámetro, la forma contundente produc…
Acknowledgements
La técnica de la presión de pulido se ha desarrollado en colaboración con Lockery SR.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glass Capillaries | Consumable | Sutter Instruments | BF150-85-10 (or similar) | The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament. |
| Inverted Microscope | Microscope | Leica | DM IL (or similar) | Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose. |
| Microforge Kit | Tool | ALA Science | CPM-2 | Supplies polishing coil, controller and foot pedal. |
| Air pressure source | Tool | ALA Science | PR-60 | Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below) |
| 4-way valve | Tool | Cole-Parmer | A-98150-01 | Fittings will be needed to couple valve to tubing |
| Pipette Holder with Luer Connector | Tool | World Precision Instruments | MPH-6S20 | Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing |
| Tygon® tubing | Tool | Cole-Parmer | 06408-62 | Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve |
Referências
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
