Forberedelse af faste Drosophila Oocytes til immunostaining: En high-throughput metode til at fastgøre og fjerne den ydre membran

- Begynd med pulserende bedøvet Drosophila sammen med buffer i en blender til at bryde op fluer i små stykker. Filtrer blandingen gennem et net for at fjerne de store kropsdele. Derefter, lad æggene synke, mens de større fragmenter forbliver på overfladen og kan fjernes.

Gentag denne proces ved hjælp af et mindre net for at fjerne yderligere snavs. Saml æggene i et hætteglas, og hvis æggene skal behandles med et lægemiddel, skal du gøre det på dette tidspunkt. Fjern derefter væsken og udskift den med fikseringsmiddel. Tilsæt heptane for at hjælpe fikseringsmidlet med at trænge ind i membranen omkring ægget.

Derefter vaskes fikseringspunktet væk med PBS. For at plette oocytterne skal du fjerne de beskyttende ydre membraner for at give mulighed for antistofindtrængning. Pipetter oocytterne på den matterede del af en glasrutsjebane. Placer en coverslip over æggene og rul forsigtigt coverlipet i en frem og tilbage bevægelse for mekanisk at adskille chorion og vitellinmembranen fra ægget. Oocytterne er nu klar til at blive farvet.

I eksemplet protokol, vil vi forberede oocytter i meiose I at plette og visualisere spindel apparatet.

- Til at begynde med, precut indersiden af en 5-milliliter rør og Pasteur pipette med PTB for at forhindre oocytter klæber til overfladerne. Tilsæt 100 milliliter Rob's buffer til en blender og derefter tilføje 100 til 300 bedøvede fluer og puls tre gange i et sekund.

Filtrer den resulterende gylle i et 250-milliliter bægerglas gennem et stort net med porer på omkring 1500 mikrometer. Lad filtratet slå sig ned i omkring to minutter og derefter indgyde det øverste lag og fjerne så mange store kropsdele som muligt.

Skyl det første bægerglas med ekstra buffer i den belagte pipette for at opsamle de resterende oocytter. Lad gyllen sætte sig i tre minutter og derefter suge alle undtagen de nederste 10 milliliter. Hæld så meget af de 10 milliliter som muligt i det belagte 5-milliliterrør. Lad gyllen afregne i omkring to minutter og fjern derefter forsigtigt væsken.

Tilsæt resten af 10 milliliter gylle og lad blandingen afregne igen, før væsken fjernes. Skyl eventuelle resterende oocytter ud af bægeret ved hjælp af ekstra buffer i den belagte pipette. Lad skylningen afregne i 5-milliliterrøret i tre til fem minutter.

For at fikse æggestokkene skal du først suge al væske fra vævene og straks tilføje 1 milliliter fikseringsblanding. Placer vævene på en nutator i to og et halvt minut. Næste tilsættes 1 milliliter heptane, vortex røret i et minut, og lad derefter oocytterne afregne i yderligere et minut.

Fjern al væske fra det afregnede væv, tilsæt derefter 1 milliliter 1x PBS. Vortex røret i 30 sekunder, og lad derefter oocytterne afregne i et minut. Derefter fjernes al væske fra røret og fyldes med fem milliliter 1x PBS.

Ved hjælp af den belagte pipette tilsæt ca. 500 til 1.000 oocytter til en frostet glasrutsjebane. Fjern eventuelle fremmede kropsdele eller materiale ved hjælp af pincet. Placer en coverlip oven på vævet, og rul forsigtigt oocyterne, indtil alle membraner er fjernet.