Voorbereiding van vaste Drosophila-oöcyten voor immunostaining: een methode met hoge doorvoer om het buitenste membraan te repareren en te verwijderen

- Begin met het pulseren van verdoofde Drosophila samen met buffer in een blender om vliegen in kleine stukjes op te breken. Filter het mengsel door een gaas om de grote lichaamsdelen te verwijderen. Laat vervolgens de eieren zinken terwijl de grotere fragmenten op het oppervlak achterblijven en kunnen worden verwijderd.

Herhaal dit proces met een kleiner gaas om extra vuil te verwijderen. Verzamel de eieren in een flacon en als de eieren met een medicijn moeten worden behandeld, doe dit dan op dit punt. Verwijder vervolgens de vloeistof en vervang deze door fixatief. Voeg heptaan toe om het fixatieve te helpen het membraan rond het ei te penetreren.

Spoel vervolgens het fixatief weg met PBS. Om de oöcyten te beitsen, verwijdert u de beschermende buitenste membranen om antilichaampenetratie mogelijk te maken. Pipetteer de oöcyten op het berijpte deel van een glazen glijbaan. Plaats een afdeklip over de eieren en rol de deklip voorzichtig heen en weer om het koraal en vitellinemembraan mechanisch van het ei te scheiden. De oöcyten zijn nu klaar om te worden gekleurd.

In het voorbeeldprotocol zullen we oöcyten in meiose I voorbereiden om het spindelapparaat te bevlekken en te visualiseren.

- Snijd om te beginnen de binnenkant van een buis van 5 milliliter en pasteurpipet met PTB voor om te voorkomen dat oöcyten aan de oppervlakken blijven plakken. Voeg 100 milliliter rob's buffer toe aan een blender en voeg vervolgens 100 tot 300 verdoofde vliegen toe en pulseer drie keer gedurende één seconde.

Filtreer de resulterende slurry in een bekerglas van 250 milliliter door een groot gaas met poriën van ongeveer 1500 micrometer. Laat het filtraat ongeveer twee minuten bezinken en aspireer vervolgens de bovenste laag, waarbij zoveel mogelijk grote lichaamsdelen worden verwijderd. Filter de slurry opnieuw in een bekerglas van 250 milliliter door een kleiner gaas met de poriegrootte van 300 micrometer.

Spoel het eerste bekerglas af met extra buffer in de gecoate pipet om de resterende oöcyten op te halen. Laat de slurry drie minuten bezinken en aspireer vervolgens alle behalve de onderste 10 milliliter. Giet zoveel mogelijk van de 10 milliliter in de gecoate buis van 5 milliliter. Laat de slurry ongeveer twee minuten bezinken en verwijder vervolgens voorzichtig de vloeistof.

Voeg de rest van de 10 milliliter drijfmest toe en laat het mengsel opnieuw bezinken voordat u de vloeistof verwijdert. Spoel de resterende oöcyten uit het bekerglas met extra buffer in de gecoate pipet. Laat de spoeling drie tot vijf minuten bezinken in de buis van 5 milliliter.

Om de eierstokken te repareren, aspireert u eerst alle vloeistof uit de weefsels en voegt u onmiddellijk 1 milliliter fix mix toe. Plaats de weefsels twee en een halve minuut op een nutator. Voeg vervolgens 1 milliliter heptaan toe, draai de buis gedurende een minuut en laat de oöcyten vervolgens nog een minuut bezinken.

Verwijder alle vloeistof uit het bezinkte weefsel en voeg vervolgens 1 milliliter 1x PBS toe. Draai de buis 30 seconden vast en laat de oöcyten vervolgens een minuut bezinken. Verwijder daarna alle vloeistof uit de buis en vul deze met vijf milliliter 1x PBS.

Voeg met behulp van de gecoate pipet ongeveer 500 tot 1.000 oöcyten toe aan een matglazen dia. Verwijder eventuele externe lichaamsdelen of materiaal met een tang. Plaats een afdeklip op het weefsel en rol de oöcyten voorzichtig totdat alle membranen zijn verwijderd. Het slepen van de rand van de deklip over de oöcyten werkt goed. Controleer periodiek de voortgang van het verwijderen van het membraan onder een microscoop. Te veel druk zal de oöcyten vernietigen.