Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Preparar larvas de Drosophila para um ensaio de sonda de calor, coletar animais do estágio de desenvolvimento desejado e transferir larvas únicas para uma placa de teste com um fino filme de água.
Larvas de drosophila detectam estímulos térmicos nocivos através de neurônios sensoriais multidendréticos em suas epiderme conhecidas como nociceptores.
Coloque a sonda de calor em uma temperatura que superará esse limiar sensorial, e fará com que os nociceptores sejam acionados. Pressione suavemente a ponta da sonda contra a larva para aplicar calor. A larva responderá à temperatura nocivas com comportamentos termo-nociceptivos, retirando-se da sonda. Pare quando a larva exibir um papel de 360 graus longe da sonda de calor, ou quando um tempo definido tiver transcorrido.
No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração de um ensaio localizado de sonda de calor no início da terceira instar larvas de Drosophila.
- Primeiro, predefinir a temperatura da sonda térmica ao ponto de partida desejado. Use um pincel ou fórceps para transferir suavemente uma larva individual para uma plataforma plana, garantindo que a lava seja coberta por uma fina película de água.
- Para minimizar a variação da pressão, bem como para garantir a localização e o ângulo corretos da sonda de calor, a prática torna-se perfeita.
- Pressione suavemente a ponta da sonda contra a larva no segmento A4, aplicando pressão leve com a ponta em cerca de um ângulo de 45 graus entre a sonda e a superfície da larva. A pressão deve causar um leve recuo na superfície da larva, e geralmente será suficiente para evitar a locomoção. Continue estimulando a larva até que uma resposta de retirada seja exibida ou até que o corte de 20 segundos seja atingido.
As larvas que respondem geralmente mostram primeiro um comportamento preliminar de elevação da cabeça e da cauda, seguidas pelo comportamento de retirada de rolamento de pelo menos 360 graus. Uma vez iniciado o comportamento de retirada, solte o contato com a sonda e registre a latência ou o tempo levado para retirada. Se nenhum comportamento de retirada for observado dentro de 20 segundos, então a larva é um não-respondente.
