La differenziazione in vitro di cellule CD4 ⁺ umana FOXP3 ⁺ indotta da T regolatorie (iTregs) da ^cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Gli obiettivi generali di questo esperimento sono l'induzione di cellule T regolatorie umane FOXP3-positive da cellule T CD4 naive in vitro e l'analisi del loro fenotipo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia delle cellule T, ad esempio come avviene la differenziazione regolatoria delle cellule T a livello molecolare? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la generazione e la fenotipizzazione riproducibili di cellule T regolatorie umane FOXP3-positive.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla differenziazione regolatoria delle cellule T, può anche essere modificato per studiare altri sottogruppi di cellule T CD4 e altre cellule immunitarie di interesse. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di isolamento dei bit PBMC e magnetici sono facili da capire quando vengono mostrate piuttosto che descritte. Per isolare le cellule T del sangue periferico, iniziare aggiungendo 15 millilitri di terreno di gradiente di densità a temperatura ambiente in cinque provette da 50 millilitri per buffy coat e portare il volume finale di buffy coat fino a 180 millilitri con PBS a temperatura ambiente.

Quindi, inclinare lateralmente una provetta di terreno a gradiente di densità e sovrapporre lentamente circa 35 millilitri di sangue diluito sul mezzo a gradiente di densità senza mescolare le soluzioni. Separare le celle mediante centrifugazione. Quindi, trasferire gli strati bianchi di PBMC tra il gradiente di densità e le fasi del plasma da ciascun tubo in nuovi tubi conici da 50 millilitri.

Lavare il PBMC con 200 millilitri di PBS fresco e risospendere i pellet in terreno completo per la deplezione dei monociti del sangue periferico mediante aderenza plastica. Dopo aver raccolto le cellule galleggianti, lavare la PBMC tre volte in un massimo di 50 millilitri di PBS fresco, rimettendo in sospensione il pellet finale in 40 microlitri di tampone di isolamento a quattro gradi Celsius e 10 microlitri di cocktail di anticorpi di biotina delle cellule T CD4-positive naive per una volta da 10 alla settima cellula con un'accurata miscelazione. Incubare le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare le cellule con 40 millilitri di PBS a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in 80 microlitri di tampone di isolamento e 20 microlitri di microsfere anti-biotina per una volta da 10 alla settima cellula per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Mentre le cellule sono in incubazione, posizionare una colonna LS su un magnete ed equilibrare con tre millilitri di tampone di isolamento, quindi lavare le cellule in 50 millilitri di PBS e risospendere il pellet in tre millilitri di tampone di isolamento fresco. Ora aggiungi le cellule alla colonna, raccogliendo il flusso naive contenente cellule T CD4-positive in una provetta da 15 millilitri. Quando la colonna smette di gocciolare, sciacquare il tubo con due millilitri di tampone isolante e trasferire il lavaggio sulla colonna.

Dopo l'ultimo lavaggio, pellettare le cellule T selezionate magneticamente mediante centrifugazione, seguita da due lavaggi in 15 millilitri di terreno, ottenendo una popolazione di cellule T CD4-positive naive pura superiore al 94%. Per indurre le cellule T regolatorie, aggiungere 50 microlitri degli stimoli appropriati ai pozzetti corrispondenti di una piastra a 96 pozzetti rivestita anti-CD3. Quindi riempire i pozzetti vuoti, compresi i pozzetti a margine, con 200 microlitri di PBS e preriscaldare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Regolare la concentrazione delle cellule T naive a riposo a una densità da 2,2 a 2,6 volte 10 al sesto per millilitro in un mezzo di 37 gradi Celsius e aggiungere 50 microlitri di cellule a ciascun pozzetto. Quando tutte le cellule sono state seminate, avvolgere la piastra in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due o tre giorni, piccoli gruppi di cellule proliferanti che emergono in gruppi più grandi in punti temporali successivi dovrebbero diventare visibili al microscopio ottico.

Dopo quattro-sei giorni, il terreno cambia da leggermente arancione a giallastro e i pellet di cellule raggruppate sono visibili ad occhio nudo. Per valutare l'espressione del marcatore della superficie cellulare, utilizzare una pipetta per risospendere le cellule in ciascun pozzetto e trasferire le cellule in una nuova piastra con fondo a U a 96 pozzetti, lasciando un pozzetto libero attorno a ciascun pozzetto per evitare la contaminazione da spillover durante il processo in piedi. Quando tutte le cellule sono state trasferite, centrifugare la piastra ed eliminare il surnatante.

Lasciando la lastra capovolta su una carta assorbente, picchiettare una volta la lastra e girarla immediatamente con il lato destro rivolto verso l'alto. Vortice per risospendere le cellule nel liquido rimanente. Quindi aggiungere 25 microlitri di premiscela superficiale a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio.

Al termine dell'incubazione, lavare i pozzetti due volte in 200 microlitri di PBS, rimuovendo il surnatante, e rimettendo in sospensione le cellule dopo ogni lavaggio, come appena dimostrato. Quindi eseguire la vitalità e la colorazione intracellulare per FOXP3 e altri marcatori di interesse. In questi grafici, viene mostrata la strategia di gating della citometria a flusso per le cellule T regolatorie CD25-positive CD4-positive FOXP3-positive.

Dopo la stimolazione in vitro, la maggior parte delle cellule regola il CD25, la cui espressione è ridotta in presenza di rapamicina. Solo con l'aggiunta di fattori Treg inducibili diventa evidente una chiara popolazione di cellule FOXP3-positive con livelli di espressione proteica intracellulare elevati come le Treg presenti in natura. Infatti, ogni condizione di Treg indotta dimostra un modello specifico e riproducibile di proliferazione cellulare.

Con il TGF beta che induce un leggero aumento della proliferazione e l'acido retinoico all-trans che aumenta drasticamente la proliferazione delle cellule T, mentre l'aggiunta di rapamicina alle colture riduce fortemente le dimensioni del cluster cellulare. L'analisi QRT-PCR delle Treg indotte indica che l'espressione dell'mRNA di FOXP3 è più alta in tutte le colture di Treg indotte rispetto alle cellule stimolate dal controllo, con le Treg indotte trattate con rapamicina che mostrano i livelli più bassi di mRNA di FOXP3 tra le colture di Treg indotte. Inoltre, si osserva che l'espressione dell'mRNA di FOXP3 nelle Treg presenti in natura è superiore a quella esibita da qualsiasi popolazione di cellule T regolatorie inducibili.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia delle cellule T per esplorare i meccanismi molecolari della generazione e della funzione delle Treg in donatori sani o in pazienti con malattie autoimmuni o cancro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule T CD4-positive naive umane e di come differenziare e fenotipizzare le NU risultanti in cellule T regolatorie. Non dimenticate che lavorare con sangue umano o paraformaldeide può essere estremamente pericoloso.

Pertanto, durante l'esecuzione di queste procedure dovrebbero essere prese in considerazione precauzioni come la pre-elaborazione, l'esecuzione di tutte le vaccinazioni, l'uso di indumenti protettivi e l'utilizzo di un corretto smaltimento dei rifiuti.