果蝇幼虫NMJ夹层
Summary
此协议示范如何解剖<em>果蝇</em>幼虫免疫组织化学和/或神经肌肉接头处的成像的准备。
Abstract
“<em>果蝇</em神经肌肉接头（NMJ）是一个建立的模型系统，用于研究突触发展和可塑性。广泛使用<em>果蝇</em>电机系统由于其高的无障碍。它可以分析单细胞的分辨率。有30％hemisegment肌肉的已知其安排在外围的体壁。在高保真的模式，共有35个运动神经元连接到这些肌肉。利用分子生物学和遗传学，可以建立转基因动物或突变体。然后，可以研究的NMJ的形态和功能上的发展后果。为了访问的研究NMJ，有必要仔细剖析每个幼虫。在这篇文章中，我们演示了如何正确地剖析<em>果蝇</em>幼虫NMJ的研究，通过消除所有的内部器官，而离开体壁不变。这种技术适用于准备成像，免疫组织化学，电或幼虫。
Protocol
在您开始之前所有的文化应该是生长在25 ° C HL3.1清扫缓冲区可能提前做好准备。以50毫升的HL3.1等份，并保持它在冰上。 准备在HL3.1 15毫升新鲜的3.5％的甲醛。保持它在冰上。 幼虫解剖放一个寒冷HL3.1的夹层板的下降。这将保持干燥和眩晕的动物，使其更容易与动物。 用长镊子 ，选择一个流浪的第三龄幼虫和HL3.1下降。 </l…
Discussion
在此视频中演示的剥离技术可用于准备各种实验技术的果蝇幼虫。如果荧光蛋白标记，幼虫可安装和成像立即。否则，免疫，可为了纪念特定的突触车厢。此外，电可以轻松地进行解剖幼虫，以评估神经递质的运作。
果蝇 NMJ年初以来，照亮它的基本结构和功能的研究已取得大受欢迎。1-4许多对果蝇NMJ的发展的研究中已确定的分子在脊椎?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss MicroImaging Inc. | 495101-9804-000 | ||
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss | 000000-1063-181 | ||
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools Inc. | 11200-33 | Long forceps | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc. | 11252-20 | Short forceps | |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp. | 3097358-1004 | Used to make dissection plates | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich Inc. | 252549-25ML | ||
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools Inc. | 26002-10 |
HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, . A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
Cite This Article
Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107, doi:10.3791/1107 (2009).