Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.
Summary
Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.
Abstract
Uno strumento essenziale per indagare il ruolo di un gene durante lo sviluppo è la capacità di eseguire knockdown gene, l'iperespressione, e gli studi misexpression. In zebrafish (<em> Danio rerio</em>), La microiniezione di RNA, DNA, proteine, oligonucleotidi antisenso e di altre piccole molecole in sviluppo dell'embrione fornisce ai ricercatori un test rapido e affidabile per esplorare la funzione del gene<em> In vivo</em>. In questo video-articolo, mostreremo come preparare e microinject<em> In vitro</em> Sintetizzato EGFP mRNA e una traslazione di blocco morfolino oligo contro<em> PKD2</em>, Un gene associato a malattia autosomica dominante del rene policistico (ADPKD), in 1 a cellule di embrioni fase zebrafish. Ci sarà quindi analizzare il successo del mRNA e microiniezioni morfolino verificando espressione GFP e analisi fenotipo. Vaste applicazioni di questa tecnica sono la generazione degli animali transgenici e la linea germinale chimere, cellule destino mappatura e lo screening del gene. Qui descriviamo un protocollo per la sovraespressione di EGFP e knockdown di<em> PKD2</em> Di mRNA e l'iniezione oligonucleotide morfolino.
Protocol
Discussion
Microiniezione in embrioni di zebrafish è una tecnica consolidata e robusta per esplorare il ruolo di un particolare gene nello sviluppo. Le applicazioni includono l'iperespressione, misexpression e saggi knockdown del gene di interesse così come l'analisi epistatico fra più geni. Microiniezione in zebrafish è stato ampiamente utilizzato per la generazione di animali transgenici, e mappatura destino delle cellule ai primi embrioni blastula 5,6,7,8,9. Inoltre, l'applicazione di questa tecnica s…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIH e PKD fondazione a ZS. Tutti gli esperimenti sugli animali sono state condotte in base a Yale Animal Resources Center (Yarc) e cura degli animali istituzionali e Usa Committee (IACUC) le linee guida.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
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