Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.
Summary
Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.
Abstract
Geliştirme sırasında bir genin rolünün araştırılması için gerekli bir araç gen demonte, aşırı ekspresyonu ve misexpression çalışmalar gerçekleştirmek için yeteneğidir. Zebrafish yılında (<em> Danio rerio</em>), Gelişmekte olan embriyonun içine RNA, DNA, proteinler, antisens oligonükleotidler ve diğer küçük moleküller mikroenjeksiyon araştırmacılar gen fonksiyonu keşfetmek için hızlı ve sağlam bir çalışma sağlar<em> In vivo</em>. Bu video makalede, biz nasıl hazırlamak ve microinject gösterecektir<em> In vitro</em> Sentezlenmiş EGFP mRNA ve translasyon engelleme morfolino oligo karşı<em> Pkd2</em> 1-hücre sahne zebrafish embriyolara otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (bireylerinde) ile ilgili bir gen. Daha sonra, GFP ifade ve fenotip analizi doğrulayarak mRNA ve morfolino microinjections başarısı analiz edecektir. Bu tekniğin geniş uygulama transgenik hayvanlar ve germ-line kimeralar üreten hücre kaderi haritalama ve gen taraması içerir. Bu yazıda tarif EGFP ve demonte aşırı ekspresyonu için bir protokol<em> Pkd2</em> MRNA ve morfolino oligonükleotid enjeksiyon.
Protocol
Discussion
Zebrafish embriyolar içine mikroenjeksiyon gelişimi belirli bir genin rol keşfetmek için köklü ve sağlam bir tekniktir. Uygulamalar ilgi yanı sıra birden fazla genin arasındaki epistatik analizi gen aşırı ekspresyonu, misexpression ve demonte deneyleri içerir. Transgenik hayvanlar oluşturma ve erken blastula embriyolar 5,6,7,8,9 hücre kaderi haritalama zebrafish içinde Mikroenjeksiyon yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, bu tekniğin uygulama hücre nakli yöntemleri 10</su…
Acknowledgements
Bu çalışma, ZS, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve PKD vakıf tarafından desteklenmiştir. Yale Hayvan Kaynakları Merkezi (YARC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) yönergeleri doğrultusunda tüm hayvan deneyleri yapılmıştır.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
References
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
