Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.
Summary
Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.
Abstract
Una herramienta esencial para investigar el papel de un gen durante el desarrollo es la capacidad de realizar caída del gen, la sobreexpresión y estudios misexpression. En el pez cebra (<em> Danio rerio</em>), La microinyección de ARN, el ADN, las proteínas, los oligonucleótidos antisentido y otras moléculas pequeñas en el embrión en desarrollo ofrece a los investigadores un ensayo rápido y robusto para explorar la función de genes<em> In vivo</em>. En este video-artículo, vamos a demostrar cómo preparar y microinject<em> In vitro</em> Sintetizado EGFP ARNm y un oligo-traslacional bloqueo contra morfolino<em> PKD2</em>, Un gen asociado con la enfermedad de herencia autosómica dominante del riñón poliquístico (PQRAD), en una de las células de embriones de pez cebra etapa. A continuación, se analizará el éxito de los ARNm y microinyecciones morfolino mediante la verificación de buenas prácticas agrarias expresión y análisis de fenotipo. Amplia gama de aplicaciones de esta técnica incluyen la generación de animales transgénicos y las quimeras de línea germinal, la cartografía de la célula-destino y la detección de genes. En este documento se describe un protocolo para la sobreexpresión de EGFP y caída de<em> PKD2</em> Por ARNm y la inyección de morfolino oligonucleótidos.
Protocol
Discussion
Microinyección en embriones de pez cebra es una técnica bien establecida y robusta para explorar el papel de un gen en particular en el desarrollo. Las aplicaciones incluyen la sobre-expresión, misexpression, y los ensayos de caída de su gen de interés, así como el análisis de epistasis entre múltiples genes. Microinyección en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para la generación de animales transgénicos y la asignación de destino de las células de los embriones tempranos de blástula 5,6,7,8,9…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH y la fundación PKD de ZS. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con Yale Centro de Recursos Animales (YARC) y Atención Institucional para las directrices del Comité (IACUC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
References
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
