Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Summary

Toepassing van elektrofysiologie toegankelijke synapsen biedt een kwantificeerbare maat van synaptische activiteit, nuttig bij het analyseren van synaptische mutanten. Dit artikel beschrijft een dissectie methode die wordt gebruikt om de neuromusculaire verbindingen (NMJ) van bloot<em> Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em> En kort bespreekt een aantal van het gebruik dat van deze voorbereiding kan worden toegepast.

Abstract

Neurotransmissie is het proces waarbij neuronen informatie via chemische signalen over te dragen aan hun post-synaptische doelstellingen, op een snelle tijdschaal. Dit complexe proces vereist de gecoördineerde activiteit van de vele pre-en post-synaptische proteïnen te zorgen voor een passende synaptische connectiviteit, geleiding van elektrische signalen, targeting en priming van secretorische vesikels, calcium, blaasje fusion, lokalisatie en functie van postsynaptische receptoren en ten slotte, recycling mechanismen. Omdat neurowetenschappers Het is ons doel om toe te lichten welke eiwitten functioneren in elk van deze stappen en begrijpen van hun werkingsmechanismen. Elektrofysiologische opnames van synapsen zorgen voor een kwantificeerbare lezen van de onderliggende elektrische gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de synaptische transmissie. Door het combineren van deze techniek met de krachtige reeks van moleculaire en genetische tools beschikbaar om synaptische eiwitten in C. te manipuleren elegans, kunnen analyseren we de resulterende functionele veranderingen in de synaptische transmissie.

De C. elegans NMJs gevormd tussen motorneuronen en lichaamswand spieren controle motoriek, dus mutanten met ongecoördineerde motorische fenotypes (bekend als unc s) vaak verstoren synaptische transmissie op deze synapsen ^1. Omdat unc mutanten worden onderhouden op een rijk aanbod van een bacteriële voedselbron, blijven ze levensvatbaar zolang ze een aantal pharynx pompen vermogen om voedsel innemen behouden. Dit, samen met het feit dat de C. elegans bestaan ​​als hermafrodieten, hen in staat stelt om op mutant nakomelingen doorgeven, zonder de noodzaak voor uitgebreide dekking gedrag. Deze eigenschappen, in combinatie met onze recente mogelijkheid om op te nemen van de wormen NMJs ^2,3,7 maken dit een uitstekend model organisme waarin u precies hoe unc mutanten invloed neurotransmissie pakken.

De dissectie methode houdt immobiliseren volwassen wormen met behulp van een cyanoacrylic lijm om een ​​incisie te maken in de worm cuticula het blootstellen van de NMJs. Sinds C. elegans volwassenen slechts 1 mm in de lengte van de dissectie wordt uitgevoerd met het gebruik van een dissectiemicroscoop en vereist een uitstekende hand-oog coördinatie. NMJ opnames zijn gemaakt door whole-cell spanning klemmen individuele lichaam muur spiercellen en neurotransmitter release kan worden opgewekt met behulp van een verscheidenheid aan stimulatie protocollen met inbegrip van elektrische stimulatie, door licht geactiveerde kanaal-rhodopsine-gemedieerde depolarisatie ⁴ en hyperosmotische zoutoplossing, die allemaal zullen worden kort beschreven.

Protocol

A. Bereiding van de instrumenten die worden gebruikt voor de dissectie. De dissectie / opname kamer: Wij typisch onze opnamestudio kamer te bouwen uit een 1 / 16 e inch magnetische plaat, met een rond gat in het centrum, dat groot genoeg is om een 22 mm diameter ronde dekglas tegemoet te komen. De buitenste afmetingen van de kamer zal afhangen van de microscoop podium gebruikt om de opnamen te doen. Op de keerzijde van de magnetische plaat, hechten wij een 48 x 60 mm dekglas, die we op de kamer hou…

Discussion

De genetische model organisme C. elegans is bij uitstek geschikt voor de studie van synaptische transmissie, door de functionele analyse van mutaties in genen die coderen voor synaptische eiwitten. Hier hebben we beschreven een dissectie techniek die de C. maakt elegans NMJs toegankelijk voor elektrofysiologische analyse. De bijhorende video toont de kritische stappen in de C. elegans dissectie en de typische opname configuratie gebruikt om de synaptische activiteit te meten. De drie …