Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Summary

Applicazione di elettrofisiologia di sinapsi accessibile fornisce una misura quantificabile di attività sinaptica, utile per analizzare mutanti sinaptica. Questo articolo descrive un metodo di dissezione utilizzati per esporre le giunzioni neuromuscolari (NMJ) di<em> Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em> E discute brevemente alcuni degli usi a cui questa preparazione può essere applicata.

Abstract

Neurotrasmissione è il processo attraverso il quale i neuroni trasferire informazioni attraverso segnali chimici per la loro post-sinaptico obiettivi, su una scala temporale rapido. Questo processo complesso richiede l'attività coordinata di molte proteine ​​pre-e post-sinaptica per assicurare corretto funzionamento della connessione sinaptica, la conduzione dei segnali elettrici, targeting e di adescamento di vescicole secretorie, il rilevamento di calcio, la fusione delle vescicole, la localizzazione e la funzione dei recettori postsinaptici e, infine, il riciclaggio meccanismi. Come neuroscienziati è il nostro obiettivo di chiarire quali proteine ​​funzione in ciascuno di questi passi e capire i loro meccanismi di azione. Le registrazioni elettrofisiologiche da sinapsi fornire una quantificabile leggere degli eventi di riferimento elettriche che si verificano durante la trasmissione sinaptica. Combinando questa tecnica con il potente gamma di strumenti molecolari e genetici disponibili per manipolare proteine ​​sinaptiche in C. elegans, possiamo analizzare le conseguenti modifiche funzionali nella trasmissione sinaptica.

Il C. elegans NMJs formano tra i neuroni motori e la parete muscolare del corpo locomozione di controllo, quindi, mutanti con fenotipi motoria scoordinata (noto come unc s) spesso perturbano la trasmissione sinaptica a queste sinapsi ^1. Dal momento che i mutanti unc sono mantenuti su una ricca offerta di una fonte di cibo batterica, rimangono valide fino a quando mantengono una certa capacità di pompaggio della faringe di ingerire cibo. Questo, unitamente al fatto che C. elegans esistono come ermafroditi, permette loro di passare per la prole mutante senza la necessità di comportamenti di accoppiamento elaborati. Queste caratteristiche, insieme alla nostra capacità di recente per registrare dal worm NMJs ^2,3,7 fanno di questo organismo un ottimo modello in cui per affrontare con precisione come unc neurotrasmissione impatto mutanti.

Il metodo di dissezione coinvolge vermi adulti immobilizzare con una colla cianoacrilica per fare un'incisione nella cuticola verme esponendo il NMJs. Dal C. adulti elegans sono solo 1 mm di lunghezza viene eseguita la dissezione con l'utilizzo di un microscopio da dissezione e richiede un'ottima coordinazione occhio-mano. NMJ registrazioni sono fatte da cellula intera tensione di serraggio singolo corpo le cellule muscolari della parete e il rilascio dei neurotrasmettitori possono essere evocati utilizzando una varietà di protocolli di stimolazione tra cui la stimolazione elettrica, la luce-attivati ​​canali rodopsina-mediata depolarizzazione ⁴ e salina iperosmotico, ognuno dei quali sarà brevemente descritto.

Protocol

A. Preparazione di strumenti utilizzati per la dissezione. La dissezione / camera di registrazione: Noi di solito costruire la nostra camera di registrazione da un 1 / 16 ° foglio pollici magnetico, con un foro circolare forato al centro che è grande abbastanza per ospitare un diametro di 22 mm circolare vetro di copertura. Le dimensioni esterne della camera dipende dal palco microscopio utilizzato per fare le registrazioni. Sul lato opposto del foglio magnetico, si allega un x 48 60 vetrino mm, …

Discussion

Il modello genetico dell'organismo C, elegans è ideale per lo studio della trasmissione sinaptica, attraverso l'analisi funzionale delle mutazioni in geni che codificano proteine ​​sinaptiche. Qui abbiamo descritto una tecnica di dissezione che rende il C. elegans NMJs accessibili per l'analisi elettrofisiologiche. Il video che accompagna la mostra passaggi critici nella C. elegans dissezione e la configurazione tipica di registrazione utilizzato per misurare l'attività s…