Protokoll för vaccinia infektion av HeLa celler och analys av värd och virus genuttryck. Del 1 av 3.
Abstract
Familjen<em> Poxviridae</em> Består av stora dubbelsträngat DNA som innehåller virus som replikerar endast i cytoplasman av infekterade celler. Medlemmar i<em> Orthopox</em> Släktet inkluderar variola, vilka smittämnen av mänskliga smittkoppor, monkeypox och vaccinia (VAC), den prototypic medlem av viruset familjen. Inom det relativt stora (~ 200 kb) vaccinia genomet, finns tre klasser av gener kodade: tidig, mellan-och sena. Även om alla tre klasser Kopierat av viralt-kodade RNA-polymeraser, serverar varje klass en annan funktion i livscykeln av viruset. Poxviruses utnyttja flera strategier för modulering i den mottagande cellulära miljön under infektion. För att förstå regleringen av både värd och virus genuttryck, har vi utnyttjat genomet-strategier för att analysera avskrift överflöd från både virus och celler värd. Här visar vi infektioner tid under HeLa celler med Vaccinia virus och RNA provtagning vid flera olika tidpunkter efter infektion. Både värd och virus total RNA isoleras och förstärks för hybridisering med microarrays för analys av genuttryck.
Protocol
Del 1: Upprättande av infektionen Väx HeLa celler i flaskor och vänta tills cellerna är ca 80% konfluenta. Förbered tillräckligt virala grogrund för experimentet: regelbunden DMEM med 2% FBS och utan tillsats av antibiotika. Infektionen kan utföras med antingen en grov lager av vaccinia virus med känd titer, eller sackaros renat virus med känd titer om du är bekymrad över värd genuttryck. Om du använder sackaros renade virus, gå direkt till del 2. Om du a…
Discussion
Kritiska steg
Del 1 & 2
Det finns flera viktiga steg för att upprätta en synkron vaccinia infektion, den första är försiktig ultraljudsbehandling (eller trypzinizing) av viruset, för att dela upp viruspartiklar. Vaccinia är mycket benägen att sammanställa, och avbrott i viruspartiklar är viktigt för att ens infektion av celler. För att uppnå en synkron infektion bör ett högt MOI (större än 2) användas för att säkerställa varje cell är infekte…
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Fonder
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
TRIzol Reagent
Reagent
Invitrogen
15596-026
Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1. J. Vis. Exp. (26), e1168, doi:10.3791/1168 (2009).