Vaccinia Virus Infektion & Temporal analys av Virus Gene Expression: Del 1
Summary
Protokoll för vaccinia infektion av HeLa celler och analys av värd och virus genuttryck. Del 1 av 3.
Abstract
Familjen<em> Poxviridae</em> Består av stora dubbelsträngat DNA som innehåller virus som replikerar endast i cytoplasman av infekterade celler. Medlemmar i<em> Orthopox</em> Släktet inkluderar variola, vilka smittämnen av mänskliga smittkoppor, monkeypox och vaccinia (VAC), den prototypic medlem av viruset familjen. Inom det relativt stora (~ 200 kb) vaccinia genomet, finns tre klasser av gener kodade: tidig, mellan-och sena. Även om alla tre klasser Kopierat av viralt-kodade RNA-polymeraser, serverar varje klass en annan funktion i livscykeln av viruset. Poxviruses utnyttja flera strategier för modulering i den mottagande cellulära miljön under infektion. För att förstå regleringen av både värd och virus genuttryck, har vi utnyttjat genomet-strategier för att analysera avskrift överflöd från både virus och celler värd. Här visar vi infektioner tid under HeLa celler med Vaccinia virus och RNA provtagning vid flera olika tidpunkter efter infektion. Både värd och virus total RNA isoleras och förstärks för hybridisering med microarrays för analys av genuttryck.
Protocol
Discussion
Kritiska steg
Del 1 & 2
Det finns flera viktiga steg för att upprätta en synkron vaccinia infektion, den första är försiktig ultraljudsbehandling (eller trypzinizing) av viruset, för att dela upp viruspartiklar. Vaccinia är mycket benägen att sammanställa, och avbrott i viruspartiklar är viktigt för att ens infektion av celler. För att uppnå en synkron infektion bör ett högt MOI (större än 2) användas för att säkerställa varje cell är infekte…
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Fonder
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| TRIzol Reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work. |
| BCP Phase Separation Reagent | Reagent | Molecular Research Center | BP151 | |
| RNase-Free DNase Set | Reagent | Qiagen | 79254 | DNase treatment is an optional step. |
References
- KH, R. u. b. i. n. s., LE, H. e. n. s. l. e. y., GW, B. e. l. l., Wang, C., EJ, L. e. f. k. o. w. i. t. z., PO, B. r. o. w. n., DA, R. e. l. m. a. n. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. a. t. e. l. l., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
