蛋白质组学鉴定蛋白质，P2X2配体门控的阳离子通道交互
1Department of Physiology,David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Anesthesiology,David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Anesthesiology, Medicine and Physiology,David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles
Summary
我们描述一个简单的协议，以确定大脑的蛋白质结合ATP门控P2X2受体的C末端全长。这种方法的延伸和系统应用到所有P2X受体预计将导致一个更好地了解P2X受体信号。
Abstract
配体门控离子通道1在中枢神经系统的突触联系的基础。在哺乳动物中，有三个家庭的配体门控通道：循环的半胱氨酸，谷氨酸门控和P2X受体通道 2 。在每一种情况下变送器具有约束力，导致毛孔开放，通过离子流及其电化学梯度。许多配体门控通道，也渗透到钙离子的3，4，有下游信号的角色（如基因调控），可能会超过通道的开放时间。因此，配体门控通道信号在广泛的时间尺度从几毫秒到数天不等。鉴于这些重要的角色，有必要了解如何配体门控离子通道本身是由蛋白质所规管，以及如何将这些蛋白质可能调整的信号。最近的研究表明许多，如果不是全部的渠道可能是部分蛋白信号复合物6。在这篇文章中，我们将解释如何识别的蛋白质结合P2X2受体胞浆域的C -末端的各个方面。
P2X受体是ATP门控的阳离子通道，由7个亚基（P2X1，P2X7）组成。 P2X受体广泛表达在大脑中，在那里他们介导兴奋性突触传递和神经递质的释放 7的突触前便利。 P2X受体在兴奋和非兴奋性细胞介导的神经信号，炎症和心血管功能 8的关键角色。 P2X2受体在神经系统的9的丰富，是本研究的重点。每个P2X亚基被认为是拥有两个膜跨越段（TM1和TM2）的，由胞外区 7和细胞内的N和C末端（图1A）7分开。 P2X亚基10（P2X1，P2X7）显示30-50％的序列同源性氨基酸水平的 11 。 P2X受体只包含三个亚基，这是最简单的离子型受体的化学计量。 P2X2 C -末端由120个氨基酸（图1b）组成，并含有几种蛋白质对接的共识网站，支持这一假设P2X2受体信号复合物的一部分。不过，虽然有几个功能已被归因于P2X2受体9 C -末端没有研究描述分子的合作伙伴，这种蛋白质通过细胞内C -末端全长夫妇。在此方法纸中，我们描述了蛋白质组学的方法来识别与P2X2受体的C -末端全长相互作用的蛋白质。
Protocol
实验步骤实验步骤（图2）包括四个部分，下面是一个分步进行的方式描述。 第1部分：亚克隆和表达P2X2受体的C -末端。 我们已经表达P2X2受体在细菌的C -末端全长识别脑蛋白与之结合。 C -末端（残基353-472）的P2X2受体（图1）经PCR扩增，克隆到PGEX 4NT1（GE生命科学）和测序验证。 重组质粒转化E.表达重组蛋白的大…
Discussion
离子通道是一个不可分割的膜蛋白的主要类。它们包含装满水的毛孔，选择性地允许跨质膜离子的运动了他们的电化学梯度。离子通道门打开和关闭状态之间。 P2X配体门控离子通道的情况下发射器（如ATP），或触发门控步骤是，它可能是由与其他蛋白的相互作用调节。在过去的十年见证在我们了解如何P2X受体结合ATP的13增加，但仍了解较少的辅助蛋白，在调节P2X功能方面的作用。在本议?…
Acknowledgements
SW和烟草花叶病毒是在美国国立卫生研究院支持的NCRR和NHLBI。 BSK和HS是由美国国立卫生研究院的NINDS和NIGMS支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
| Glycerol | EMD | GX0185-6 |
References
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Tags
ProteomicsProteinsP2X2 Ligand-gated Cation ChannelsLigand-gated Ion ChannelsSynaptic CommunicationNervous SystemCys LoopGlutamate-gated ChannelsP2X Receptor ChannelsTransmitter BindingPore OpeningIons FlowElectrochemical GradientsCalcium IonsDownstream Signaling RolesGene RegulationProtein Signaling ComplexesC-terminal AspectsP2X2 Receptor Cytosolic DomainATP-gated Cation ChannelsSubunitsExcitatory Synaptic TransmissionNeurotransmitter ReleaseExcitable CellsNon-excitable CellsNeuronal SignalingInflammationCardiovascular Function
Cite This Article
Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178, doi:10.3791/1178 (2009).