Протеомики для идентификации белков Взаимодействие с P2X2 лиганд-Gated Каналы Катионит
Summary
Мы опишем простой протокол для идентификации белков мозга, которые связывают с полной конечной длины C АТФ закрытого P2X2 рецепторов. Расширение и систематическое применение этого подхода ко всем Р2Х рецепторов, как ожидается, приведет к лучшему пониманию сигнализации рецептора Р2Х.
Abstract
Лиганд-ионные каналы лежат в основе синаптической связи в нервной системе 1. У млекопитающих Есть три семейства лиганд закрытого канала: цис цикла, глутамат-закрытого типа, и Р2Х каналов рецепторов 2. В каждом случае связывания передатчика приводит к открытию поры, через которые ионы стекают их электрохимического градиента. Многие лиганд-закрытый каналы также проницаемой для ионов кальция, 3, 4, которые ниже по течению сигнализации ролей 5 (например, регуляции генов), которые могут превышать длительность канал открытия. Таким образом лиганд закрытого канала может сигнализировать о более широком масштабе времени от нескольких миллисекунд до нескольких дней. Учитывая эти важные роли надо понять, как лиганд закрытого ионных каналов сами регулируются белками, и как эти белки могут настроить сигнализацию. Последние исследования показывают, что многие, если не все, каналы могут входить в состав белка сигнализации комплексы 6. В этой статье мы объясним, как идентифицировать белки, которые связываются с С-концевой аспекты P2X2 рецептор цитозольного домена.
Р2Х рецепторы АТФ-каналов закрытого катионов и состоит из семи подразделений (P2X1-P2X7). Р2Х рецепторы широко выражается в головной мозг, где они посредником возбуждающие синаптической передачи и пресинаптического облегчения нейромедиатора выпуска 7. Р2Х рецепторы находятся в возбудимых и не возбудимых клеток и посредником ключевую роль в нейронной сигнализации, воспаление и сердечно-сосудистой функции 8. P2X2 рецепторы широко распространены в нервной системе, а 9 находятся в центре внимания данного исследования. Каждая субъединица Р2Х, как полагают, обладают двумя мембрану сегментов (TM1 и TM2), разделенных внеклеточной области 7 и внутриклеточных N и С, концы (рис. 1а) 7. Р2Х подразделения 10 (P2X1-P2X7) показывают 30-50% последовательность гомологии на уровне аминокислот 11. Р2Х рецепторы содержат только три подразделения, что является самым простым стехиометрии среди ионотропных рецепторов. P2X2 С-конца состоит из 120 аминокислот (рис. 1б) и содержит несколько сайтов стыковочного белка консенсуса, в пользу гипотезы, что P2X2 рецепторов может быть частью сигнализации комплексов. Однако, несмотря на несколько функций были отнесены к С-конце P2X2 рецепторов 9 ни одно исследование не описаны молекулярные партнеров, которые пару к внутриклеточной стороне этого белка по всей длине C-конца. В этой статье мы опишем методы протеомных подход к определению белков, которые взаимодействуют с полной длины С-конце P2X2 рецепторов.
Protocol
Discussion
Ионные каналы являются одной из основных класса интегральных мембранных белков. Они содержат заполненных водой поры, избирательно разрешить перемещение ионов вниз их электрохимического градиента через плазматическую мембрану. Ионные каналы ворота между открытым и закрытым состоян?…
Acknowledgements
SW и ВТМ поддерживаются NCRR и NHLBI в Национальном институте здравоохранения. БСК и HS поддерживает NINDS и NIGMS Национального института здоровья.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
| Glycerol | EMD | GX0185-6 |
References
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).
- Burnashev, N. Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Khakh, B. S., North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature. 442, 527-532 (2006).
- Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).
- Khakh, B. S. International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.. Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).
- Young, M. T. Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy. J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).
- Edmondson, R. D. Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS. Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).
- Evans, R. J. Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).
