אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזהות חלבונים במוח אשר נקלטות על ידי התחנה הסופית C מלא אורכו של ה-ATP-מגודרת P2X2 קולטנים. הרחבה ויישום שיטתי של גישה זו כל הקולטנים P2X צפוי להוביל להבנה טובה יותר של איתות לקולטן P2X.
ליגנד-מגודרת תעלות יונים ביסוד תקשורת הסינפטי במערכת העצבים 1. אצל יונקים יש שלוש משפחות של ליגנד-מגודרת ערוצים: את הלולאה cys, גלוטמט ו-מגודרת ערוצי קולטן P2X 2. בכל מקרה המחייב של המשדר המוביל פתיחת הנקבוביות שדרכו יונים לזרום למטה הדרגתיים אלקטרוכימיים שלהם. רבים ליגנד-מגודרת הערוצים גם חדיר יוני סידן 3, 4, אשר במורד איתות תפקידים 5 (תקנה למשל גן) כי תעלה את משך הזמן של פתיחת הערוץ. לפיכך ליגנד-מגודרת ערוצי יכולה לאותת על סולמות זמן רחב החל כמה אלפיות כדי ימים. בהינתן אלה תפקידים חשובים יש צורך להבין כיצד ליגנד-מגודרת תעלות יונים עצמם מוסדרים על ידי חלבונים, ואיך החלבונים האלה עשויים לכוון איתות. מחקרים אחרונים מצביעים על כך רבות, אם לא כולם, ערוצי עשוי להיות חלק קומפלקסים חלבונים איתות 6. במאמר זה נסביר כיצד לזהות את החלבונים אשר נקלטות על ידי ה-C-מסוף ההיבטים של תחום P2X2 הקולטן cytosolic.
קולטנים P2X הם ATP-מגודרת ערוצי קטיון וכוללת שבע יחידות משנה (P2X1-P2X7). קולטנים P2X באים לידי ביטוי נרחב במוח, שם הם לתווך שידור סינפטיים מעוררים ועל סיוע presynaptic של שחרור הנוירוטרנסמיטר 7. קולטנים P2X נמצאים תאים להתרגש ולא להתרגש לתווך תפקידי מפתח איתות דלקת עצבית, ותפקוד הלב וכלי הדם 8. P2X2 קולטנים נפוצים במערכת העצבים 9 הם המוקד של המחקר הזה. למקטע כל P2X נחשב בעל שני חלקים קרום פורש (TM1 & TM2) מופרדים על ידי אזור תאי 7 ו-N ו-C תאיים טרמיני (איור 1a) 7. יחידות משנה P2X 10 (P2X1-P2X7) מראים הומולוגיה ברצף 30-50% ברמת חומצת אמינו 11. קולטנים P2X מכילים רק שלוש יחידות משנה, המהווה את stoichiometry הפשוטה בין קולטנים ionotropic. P2X2 C-הסופית כוללת של 120 חומצות אמינו (איור 1b) והוא מכיל כמה חלבון העגינה אתרים קונצנזוס, התומכים בהשערה כי P2X2 קולטן עשוי להיות חלק מתחמי איתות. עם זאת, למרות מספר פונקציות יוחסו הסופית-C של P2X2 קולטנים 9 המחקר לא תיאר את השותפים מולקולרית כי בני הזוג לצד תאיים של חלבון זה דרך באורך מלא C-הסופית. במאמר זה אנו מתארים שיטות גישה proteomic לזהות את החלבונים אינטראקציה עם באורך מלא C-הסופית של P2X2 קולטנים.
תעלות יונים הם קבוצה גדולה של חלבונים בממברנה נפרד. הם מכילים מים מלא נקבוביות כי סלקטיבי לאפשר תנועה של יונים מטה הדרגתיים אלקטרוכימי על פני קרום התא. יון ערוצי השער פתוח בין המדינות סגור. צעד gating מופעלת על ידי משדרי (למשל ATP) במקרה של P2X ערוצי ליגנד מגודרת יון, או שהוא …
SW ו TMV נתמכים על ידי NCRR ו NHLBI במכון הלאומי לבריאות. BSK ו HS נתמכים על ידי NINDS ו NIGMS של מכוני הבריאות הלאומיים.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
Glycerol | EMD | GX0185-6 |