معالجة Loblolly باين PtGen2 ميكروأري [كدنا]
Summary
وضعت [كدنا] [ميكروأري PtGen2 للدراسات التعبير الجيني في loblolly الصنوبر ،<em> P. taeda</em> ، والأنواع الأخرى الصنوبرية. هنا ، ونعرض ما قبل وما بعد التهجين المناولة وغسل التقنيات التي يمكن استخدامها مع هذه المجموعة لانتاج أفضل الاتساق والتحف المنخفض ، وانخفاض الخلفيات.
Abstract
PtGen2 هو ميزة [كدنا] [ميكروأري 26496 تحتوي على تضخيم الصنوبر loblolly التكنولوجيات السليمة بيئيا. وينتج الصفيف في مختبرنا للاستخدام من قبل الباحثين الذين يدرسون التعبير الجيني في الأنواع الصنوبرية الصنوبر وغيرها. وقد وضعت PtGen2 نتيجة لجهودنا اكتشاف الجينات في loblolly الصنوبر ، وتتألف من سلاسل المحددة أساسا من أنسجة الجذر ، ولكن أيضا من إبرة والخلايا الجذعية ، وقد تم اختباره من قبل 1،2 PtGen2 التهجين المختلفة المستهدفة الصنوبرية CY – صبغ المسمى cDNAs ، باستخدام كل من تضخيمها وتضخيم عدم وضع العلامات ، طرق غير مباشرة ، واختبارها أيضا مع عدد من الشروط التهجين والغسيل. هذا الفيديو يركز على معالجة وتصنيع الشرائح قبل وبعد مرحلة ما قبل التهجين ، وكذلك بعد التهجين ، وذلك باستخدام بعض التعديلات على الإجراءات التي وضعت سابقا. 3،4 شملت أيضا ، في شكل النص فقط ، هي البروتوكولات المستخدمة للجيل ، وضع العلامات وتنظيف الهدف من ليالي [كدنا] ، وكذلك معلومات عن البرمجيات المستخدمة لمعالجة البيانات المصب.
طبعت PtGen2 مع العازلة طباعة الشخصية التي تحتوي على تركيزات عالية من الملح يمكن أن يكون من الصعب إزالته تماما. تغسل الشرائح الأولى في حل SDS الدافئ قبل قبل التهجين. بعد التهجين المسبق ، تغسل الشرائح بقوة في العديد من التغييرات من المياه لاستكمال إزالة الأملاح المتبقية. ثم يتم تنظيف LifterSlips ™ ووضعها على الشرائح والمسمى [كدنا] تحميل بعناية وعلى ميكروأري عن طريق العمل الشعري الذي ينص على توزيع العينة حتى عبر الشريحة ، ويقلل من فرصة التأسيس الفقاعة. يتم تهجين من الأهداف إلى الصفيف في 48 درجة مئوية في ظروف الرطوبة العالية. بعد التهجين ، يتم إجراء سلسلة من يغسل قياسية بلغت 53 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة لفترات طويلة. تجهيز PtGen2 الشرائح باستخدام هذا الأسلوب يقلل من الملح وSDS المستمدة من التحف غالبا ما ينظر إليها عند معالجة مجموعة أقل صرامة. التهجين الأهداف المستمدة من مصادر مختلفة عدة RNA الصنوبرية ، أسفرت عن عدد أقل من هذا البروتوكول تجهيز القطع الأثرية ، الخلفية مخفضة ، وتقديم أفضل الاتساق بين المجموعات التجريبية المختلفة من الالواح.
Protocol
Discussion
PtGen2 هو ، والعرف وضعت مؤخرا [كدنا] [ميكروأري التي تم تصميمها ليتم استخدامها في المقام الأول من قبل المجتمع البحوث loblolly الصنوبر. النتائج الأولية ولدت حتى الآن أظهرت الصفيف إلى أن تكون أداة قيمة في تقييم الأحداث التي تحدث في الترانسكربتي استجابة لضغط الجفاف ، وكذلك في رص…
Acknowledgements
ووضع العلامات ، والتهجين ، والبروتوكولات الغسيل تحتوي على بعض التعديلات على الوثيقة التي وضعت من قبل الدكتور جي. Quackenbush بينما في معهد للبحوث الجينوم (TIGR) ، الدكتور شون ليفي في الموارد المشتركة ميكروأري فاندربيلت (VMSR) ، والدكتور في حين تسلب ألبا في معهد بويس تومسون (BTI) جامعة كورنيل.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. . unpublished data. , .
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D’Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).
