Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray
Summary
Die cDNA-Microarray PtGen2 war für die Genexpression Studien in loblolly Kiefer entwickelt,<em> P. taeda</em> Und andere Nadelbaumarten. Hier zeigen wir Pre-und Post-Hybridisierung Bearbeitung und Reinigung Techniken, die mit diesem Array verwendet werden, um eine bessere Konsistenz, verringert Artefakte und unteren Hintergründe liefern kann.
Abstract
PtGen2 ist ein 26.496-Funktion cDNA-Microarray mit verstärkten loblolly Kiefer ESTs. Das Array wird in unserem Labor für die Nutzung durch Forscher studieren die Genexpression in Kiefern und andere Nadelhölzer hergestellt. PtGen2 wurde als Ergebnis unserer Bemühungen zur Entdeckung von Genen in loblolly Kiefer entwickelt und wird von Sequenzen in erster Linie aus Wurzelgewebe identifiziert umfasst, sondern auch aus Nadel-und Stammzellen. 1,2 PtGen2 durch Kreuzungen verschiedener Cy-Farbstoff markiert Nadelbaum Ziel cDNAs wurde getestet , wobei sowohl verstärkt und nicht verstärkt indirekte Markierung Methoden und auch mit einer Reihe von Hybridisierung und Waschen Bedingungen getestet. Dieses Video konzentriert sich auf die Handhabung und Verarbeitung von Folien vor und nach dem Pre-Hybridisierung, sowie nach der Hybridisierung mit einigen Modifikationen der Verfahren entwickelt zuvor. 3,4 Ebenfalls enthalten in Textform nur, sind die Protokolle für die Erzeugung, Kennzeichnung und Reinigung von Ziel-cDNA s, sowie Informationen über Software für Downstream-Verarbeitung verwendet.
PtGen2 ist mit einem proprietären Druckpuffer, dass hohe Konzentrationen von Salz, die nur schwer vollständig zu entfernen Dose enthält gedruckt. Die Folien werden zunächst in einem warmen SDS-Lösung vor pre-Hybridisierung gewaschen. Nach einer Vorauswahl Hybridisierung werden die Objektträger kräftig in mehrere Änderungen des Wasser gewaschen, um das Entfernen der restlichen Salze abzuschließen. LifterSlips ™ werden dann gereinigt und positioniert auf den Folien und markierte cDNA wird vorsichtig auf dem Mikroarray durch Kapillarwirkung, die für eine gleichmäßige Verteilung der Probe auf den Objektträger bietet geladen, und verringert die Chance von bubble Statuten. Hybridisierung von Zielen auf das Array wird bei 48 ° C bei hoher Luftfeuchtigkeit durchgeführt. Nach der Hybridisierung wird eine Reihe von Standard-Wäschen bei 53 ° C durchgeführt und Raumtemperatur für längere Zeit. Verarbeitung PtGen2 Dias mit dieser Technik reduziert Salz und SDS-derived Artefakte oft gesehen, wenn das Array weniger streng verarbeitet wird. Hybridisierende Ziele aus verschiedenen Koniferen RNA Quellen stammen, ergab diese Verarbeitung Protokoll weniger Artefakte, reduziert Hintergrund, und sofern eine bessere Konsistenz zwischen den verschiedenen experimentellen Gruppen von Arrays.
Protocol
Discussion
PtGen2 ist eine neu entwickelte, individuelle cDNA-Microarray, die entworfen, um in erster Linie durch die loblolly Kiefer Forschung verwendet werden sollte. Vorläufige Ergebnisse generiert bislang haben das Array gezeigt, dass ein wertvolles Hilfsmittel bei der Bewertung der Transkriptions-Ereignisse, die in Reaktion auf Trockenstress auftreten, sowie bei der Überwachung der Veränderungen, die während der Embryonalentwicklung entstehen in Pinien, Pinus pinaster 5,6 Wir haben auch kürzlich gezei…
Acknowledgements
Die Kennzeichnung, Hybridisierung und Waschen Protokolle hierin enthalten einige Änderungen an, die zuvor von Dr. J. Quackenbush während der Institute for Genomic Research (TIGR), Dr. Shawn Levy an der Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR) entwickelt, und Dr. Rob Alba während der Boyce Thompson Institute (BTI) Cornell University.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
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