İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray
Summary
CDNA mikroarray PtGen2 Loblolly çam gen ekspresyon çalışmaları için geliştirilmiştir<em> S. taeda</em> Ve diğer kozalaklı türler. Burada, öncesi ve sonrası hibridizasyon teknikleri, daha iyi bir tutarlılık, eserler, ve alt arka planlar verim için bu dizi ile birlikte kullanılabilir taşıma ve yıkama.
Abstract
PtGen2 amplifiye Loblolly çam EST'ler içeren 26.496 özelliği cDNA mikroarray. Dizi, çam ve diğer kozalaklı türlerin gen ekspresyonu eğitim araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere laboratuvarda üretilir. PtGen2 Loblolly çam gen bulma çabalarının bir sonucu olarak geliştirilen ve öncelikle kök dokuları tespit dizileri oluşur, ama aynı zamanda iğne ve kök 1,2 PtGen2 farklı etiketli Cy-boya kozalaklı hedef cDNAs literatürde tarafından test edilmiştir amplifiye ve amplifikatör içermeyen dolaylı etiketleme yöntemleri ve hibridizasyon ve yıkama koşulları bir dizi test. Bu video bazı değişiklikler önceden geliştirilmiş yöntemler kullanılarak, hem de melezleme sonra, ön hibridizasyon öncesi ve sonrası slayt taşıma ve işleme üzerine odaklanmaktadır. 3,4 Ayrıca dahil olanlar, sadece metin biçiminde, üretim için kullanılan protokoller, etiketleme ve hedef cDNA s kadar temiz yanı sıra yazılım hakkında bilgi downstream veri işleme için kullanılır.
PtGen2 tamamen kaldırmak için zor olabilir yüksek konsantrasyonlarda tuz içeren özel bir baskı tamponu ile yazdırılır. Slaytlar ön hibridizasyon için önce sıcak bir SDS çözümü ilk olarak yıkanır. Ön hibridizasyon sonra, slaytlar kalan tuzları kaldırma işleminin tamamlanması için çeşitli değişikliklere su kuvvetlice yıkanır. LifterSlips ™ sonra temizlenmiş ve slaytlar üzerinde konumlandırılmış ve cDNA etiketli dikkatle slaytta örnek eşit dağılımını sağlayan kılcal eylem yoluyla mikroarray üzerine yüklenen ve kabarcık esas şansını azaltır. Dizi hedefleri Hibridizasyon 48 ° C'de yüksek nem koşullarında yapılır. Hibridizasyon sonra, bir dizi standart yıkar 53 yapılır ° C ve oda sıcaklığında uzun zamanlar için. İşleme PtGen2 slaytlar bu tekniği kullanarak tuz azaltır ve SDS-elde edilen eserler genellikle dizi daha titiz bir şekilde işlenir. Birkaç farklı kozalaklı RNA kaynaklardan elde edilen hedeflere literatürde, bu işlem protokolü, daha az eser, azaltılmış arka plan verdi ve dizilerin farklı deneysel gruplar arasında daha tutarlı.
Protocol
Discussion
PtGen2 öncelikle Loblolly çam araştırma topluluğu tarafından kullanılmak üzere tasarlanmış kısa bir süre önce geliştirilen, özel cDNA mikroarray. Üretilen ön sonuçları, bu nedenle çok değerli bir araç transkripsiyonel kuraklık stresine yanıt olarak ortaya çıkan olayların yanı sıra, deniz, çam, Pinus pinaster Şu anda 5,6 embriyo gelişimi sırasında meydana gelen değişiklikleri izleme gibi değerlendirilmesi için dizi göstermiştir yakın zamanda 5 PtGen2…
Acknowledgements
Etiketleme, hibridizasyon ve yıkama protokolleri burada bazı Dr. J. Quackenbush, Genom Araştırma (TIGR), Vanderbilt Mikroarray Paylaşımlı Kaynak (VMSR) Dr. Shawn Levy Enstitüsü'nde ise daha önce geliştirilen bu modifikasyon, ve Dr. Içeren Rob Alba Boyce Thompson Enstitüsü, (BTI) Cornell Üniversitesi sırasında.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. . unpublished data. , .
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D’Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).
