Bearbetning av Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray
Summary
Den cDNA microarray PtGen2 har utvecklats för studier genuttryck i Loblolly tall,<em> P. taeda</em> Och andra barrträd arter. Här visar vi pre-och post-hybridisering hantering och tvätt tekniker som kan användas med denna array ge bättre konsistens, minskade artefakter, och lägre bakgrunder.
Abstract
PtGen2 är en 26.496 funktion cDNA microarray innehåller förstärkta EST Loblolly furu. Matrisen är producerad i vårt laboratorium för att användas av forskare att studera genuttryck i furu och andra barrträd arter. PtGen2 utvecklades som ett resultat av våra ansträngningar genfynd i Loblolly furu och består av sekvenser identifieras främst från roten vävnader, men även från nål och stjälk. 1,2 PtGen2 har testats av hybridisering olika Cy-dye märkt barrträd mål cDNAs , med både förstärks och icke-förstärkta indirekta märkning metoder, och även testat med ett antal hybridisering och tvätt förhållanden. Denna video fokuserar på hantering och bearbetning av bilder före och efter pre-hybridisering, och efter hybridisering, med några ändringar av förfaranden som utvecklats tidigare. 3,4 ingår också, i textform bara är de protokoll som används för generering, märkning och sanering av mål cDNA s, samt information om programvara som används för nedströms databehandling.
PtGen2 är tryckt med en egen utskrift buffert som innehåller höga halter av salt som kan vara svåra att få bort helt. Bilderna tvättas först i en varm SDS lösning innan pre-hybridisering. Efter pre-hybridisering, är bilderna tvättas kraftigt i flera byten av vatten för att fullständigt avlägsnande av återstående salter. LifterSlips ™ är sedan rengörs och placeras på bilderna och märkt cDNA är noga lastas på microarray genom kapillärkraft som innebär jämn fördelning av urvalet över bilden, och minskar risken för bubblan bolagsordningen. Hybridisering av mål för att matrisen sker vid 48 ° C i hög luftfuktighet. Efter hybridisering, är en serie av standard tvättar sker vid 53 ° C och rumstemperatur under längre tider. Bearbetning PtGen2 bilder med denna teknik minskar salt och SDS-derived artefakter ofta när matrisen behandlas mindre strängt. Hybridisering med utgångspunkt från flera olika barrträd RNA källor, gav denna behandling protokoll färre artefakter, minskad bakgrund och givit bättre konsekvens mellan olika experimentella grupper av matriser.
Protocol
Discussion
PtGen2 är en nyligen utvecklad, anpassad cDNA microarray som var avsedd att användas främst av Loblolly tall forskarsamhället. Preliminära givit resultat hittills har visat arrayen att vara ett värdefullt verktyg i utvärderingen av transkriptionell händelser som inträffar till följd av torka stress, samt att övervaka förändringar som sker under embryots utveckling i maritima tall, Pinus pinaster 5,6 Vi har också nyligen visat att PtGen2 fungerar bra i över arter hybridizations med rikt…
Acknowledgements
Märkning, hybridisering och tvätt protokollen innehåller häri några ändringar av dessa tidigare utvecklat av Dr J. Quackenbush samtidigt som Institutet för genomisk forskning (TIGR), Dr Shawn Levy vid Vanderbilt Microarray Delad Resurs (VMSR), och Dr Rob Alba medan på Boyce Thompson Institute, (BKB) Cornell University.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. . unpublished data. , .
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D’Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).
