La détection des protéines ubiquitination

Summary

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture<em> In vivo</emTubes> et le test<em> In vitro</em>.

Abstract

L'ubiquitination, la fixation covalente de l'ubiquitine polypeptide de cibler les protéines, est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Ils comprennent l'enzyme activant l'ubiquitine-E1, E2 enzyme conjuguant l'ubiquitine et ubiquitine ligase E3. Contrairement à E1 et E2, E3 ubiquitine ligases la spécificité de substrat d'affichage. D'autre part, de nombreuses enzymes deubiquitylating ont des rôles dans le traitement des protéines polyubiquitinated. L'ubiquitination peut entraîner un changement de la stabilité des protéines, localisation cellulaire et l'activité biologique. Des mutations de gènes impliqués dans la voie d'ubiquitination / déubiquitination ou altération de la fonction système ubiquitine sont associés à différentes pathologies humaines telles que divers types de cancer, maladies neurodégénératives et les troubles métaboliques. La détection de l'ubiquitination altérée ou normale de protéines cibles peuvent fournir une meilleure compréhension de la pathogenèse de ces maladies. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture<em> In vivo</emTubes> et le test<em> In vitro</em>. Ces protocoles sont également utiles pour détecter d'autres ubiquitine-like modification de petites molécules telles que sumolyation et neddylation.

Protocol

Détection de l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture Transfecter des cellules en culture avec des plasmides exprimant la protéine d'intérêt et (épitope taggés version de) l'ubiquitine. Faire complète du tampon de lyse cellulaire (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0) avec orthovanadate de sodium 2 mM, 50 mM de fluorure de sodium, et les inhibiteurs de protéase. Lyse des cellules avec tampon de 100 cellules lyse ul par plaque (6 vaisselle cm). …

Discussion

Dans cette présentation, nous avons d'abord décrit les étapes qui permettent de détecter la modification d'ubiquitine sur une protéine d'intérêt dans des cultures de cellules de mammifères. Afin de détecter spécifiquement sur ​​l'ubiquitination de la protéine d'intérêt, non pas sur les protéines qui interagissent de façon non covalente, nous avons utilisé une condition stricte pour la lyse cellulaire, immunoprécipitation et de lavage ^1,3. L'ubiquitination, détect?…